肝癌代謝組學(xué)及藍(lán)萼甲素干預(yù)機(jī)制研究.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌是一種最常見的腹內(nèi)惡性腫瘤，其死亡率在惡性腫瘤中位列第二位，是嚴(yán)重威脅我國人民生命健康的疾病。然而目前的肝癌診斷技術(shù)與治療方法并不能滿足人們的需求，因此我們迫切地需要尋找新的早期診斷標(biāo)志物，并發(fā)現(xiàn)新的能夠更有效治療肝癌的藥物。本論文結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用、氣質(zhì)聯(lián)用和核磁共振等多種分析技術(shù)，聯(lián)合代謝組學(xué)的研究模式對肝癌與藍(lán)萼甲素進(jìn)行了研究，旨在系統(tǒng)地探尋肝癌的本質(zhì)和藍(lán)萼甲素的作用機(jī)理:
　　樣品前處理是代謝組學(xué)研究的第一步，選擇較好

2、的前處理方法為得到可靠的結(jié)果奠定了基礎(chǔ)。在液質(zhì)樣品前處理優(yōu)化方面，通過綜合所有提取溶劑所得的代謝物特征峰的總數(shù)、整體代謝物RSD的分布與主成分分析的結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)了幾種優(yōu)化的血漿制備方法。即在反相色譜柱分析中，甲醇/乙醇與甲醇/乙醇/乙腈這兩種混合溶劑是相對來說比較優(yōu)化的方法;而在親水作用色譜柱分析中，甲醇/乙腈與乙醇/乙腈這兩種提取混合提取溶劑是綜合來說比較好的選擇。在氣質(zhì)樣品前處理優(yōu)化方面，傳統(tǒng)的氣質(zhì)樣品前處理方法步驟繁瑣、耗時(shí)漫

3、長，應(yīng)用微波輔助的方法完成肟化與硅烷基化進(jìn)行血漿樣品的制備為我們提供了一種耗時(shí)較短和效率更高的選擇。接下來，通過響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)的方案有效地優(yōu)化了微波輔助肟化和硅烷基化的條件，并在不影響提取物數(shù)目與含量的前提下，將原來180分鐘的制備時(shí)間縮短到5分鐘。這種創(chuàng)新的微波輔助技術(shù)十分有效并省時(shí)，該方式提供了一種高通量制備代謝組學(xué)血漿樣本的方法。
　　基于之前優(yōu)化的樣品前處理方法，通過核磁共振和液質(zhì)聯(lián)用等分析方法并結(jié)合隨機(jī)森林算法，對肝細(xì)胞

4、肝癌患者、肝硬化患者和健康志愿者的血清樣本進(jìn)行了代謝輪廓分析。根據(jù)三種分析方法的數(shù)據(jù)鑒定了三十二個(gè)潛在生物標(biāo)志物，并且使用這些生物標(biāo)志物建立的模型對肝細(xì)胞肝癌診斷的可行性進(jìn)行了評估。結(jié)果表明，即使是在很多肝細(xì)胞肝癌患者的AFP值低于20ng/mL的情況下，區(qū)分肝細(xì)胞肝癌患者和肝硬化患者的過程中該模型實(shí)現(xiàn)了幾乎100％的敏感性和特異性。肝細(xì)胞肝癌引起的代謝通路改變包括了:酮體合成代謝，檸檬酸循環(huán)，磷脂代謝，鞘脂類代謝，脂肪酸氧化，氨基酸分

5、解代謝和膽汁酸代謝通路。本章的結(jié)果表明，這些鑒定的潛在生物標(biāo)志物可能為肝細(xì)胞肝癌患者的早期診斷和預(yù)后評估帶來了新的契機(jī)。此外，本研究還證明了，隨機(jī)森林分類算法適合用于篩選代謝組學(xué)的潛在生物標(biāo)志物。
　　之后，本課題組利用GC-MS、RPLC-MS和HILIC-MS三種分析方法來探索GLA給藥組與正常對照組之間的代謝物變化，并進(jìn)一步將所得到的數(shù)據(jù)輸入到多變量分析方法中研究。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證明了GLA對SMMC7721肝癌細(xì)胞有抑制作

6、用之后，利用細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了GLA對肝癌細(xì)胞的影響。接著，通過PCA與OPLS-DA分析手段選擇并驗(yàn)證了24個(gè)生物標(biāo)志物。本研究從整體代謝水平來評價(jià)GLA給藥對SMMC7721肝癌細(xì)胞系的影響，并且對它抑制肝癌細(xì)胞的機(jī)制做出一定的闡述。這將有助于進(jìn)一步了解這個(gè)疾病的發(fā)展，也將有助于使用與評估藥物的療效以及藥物的作用方式。研究中篩選發(fā)現(xiàn)的潛在生物標(biāo)志物涉及到了很多代謝通路，這表明GLA可以通過影響脂類代謝、鞘脂代謝、嘌呤