基于動物腫瘤模型的LC-MS-MS代謝組學及藥物代謝組學方法研究.pdf

1、本論文采用正、負離子檢測相結(jié)合的電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)分析手段,建立了基于RPLC-MS/MS和HILIC-MS/MS互補的代謝組學分析方法,并將差異代謝物動態(tài)行為分析整合到代謝組學研究中,開展了Walker256腫瘤模型的代謝組學研究,以尋找與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)的生物標志物。在此基礎上開展了抗腫瘤藥物10-羥基喜樹堿(HCPT)的藥物代謝組學研究,旨在同時獲得在不同病理狀態(tài)下藥物的代謝產(chǎn)物及藥物引起的內(nèi)源性代謝物的變化。在Wal

2、ker256腫瘤模型的代謝組學研究中,共發(fā)現(xiàn)了47個呈規(guī)律性變化且與腫瘤發(fā)展過程緊密相關(guān)的可能生物標志物,并鑒定出15個標志物的結(jié)構(gòu),其中包括9個動態(tài)變化行為相似的中鏈脂酰肉堿類代謝物,其反映了Walker256腫瘤大鼠體內(nèi)長鏈脂肪酸β-氧化的下調(diào)。此外,在HCPT的藥物代謝組學研究中,通過給予高、低劑量HCPT的正常大鼠與Walker256腫瘤大鼠尿液之間的系統(tǒng)比較分析,不僅尋找到HCPT原形及其葡萄糖醛酸結(jié)合物,并發(fā)現(xiàn)了14個與HC

3、PT的毒性、藥效作用相關(guān)的內(nèi)源性代謝物,同時篩選出6個更可靠的腫瘤生物標志物和3個HCPT敏感性標志物。上述研究表明,本研究方法不僅有助于發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)的生物標志物,而且為生物體的代謝異常和腫瘤進程提供重要的生物學信息；采用代謝組學方法研究藥物體內(nèi)代謝過程及藥物引起的內(nèi)源性小分子代謝物的變化,可以獲取藥物代謝產(chǎn)物,以及與藥物毒性和藥效作用相關(guān)的代謝物等多種信息。
　　 本論文的研究內(nèi)容主要包括以下四個部分:
　　

4、 1.基于LC-MS技術(shù)的大鼠尿液代謝組學分析方法研究
　　 為了改善尿液中強極性代謝物的分析,本研究在“互補性”分析思路的指導下,將HILIC-MS與RPLC-MS方法相結(jié)合分別對尿液經(jīng)固相萃取(SPE)后的水洗脫部位和甲醇洗脫部位進行了系統(tǒng)分析。以尿液中代表性小分子代謝物為分析對象,重點對方法的精密度、靈敏度和回收率進行了細致的考察,結(jié)果表明本方法精密度好,且對大部分被分析物靈敏度高,回收率良好,能夠滿足代謝組學中尿液樣本分

5、析的要求。因此,本研究采用正、負離子檢測模式相結(jié)合的RPLC—MS/MS和HILIC-MS/MS手段,建立了適用于大鼠尿液樣本的代謝組學分析方法。
　　 2.基于Walker256腫瘤模型的代謝組學研究
　　 本研究采用建立的代謝組學分析方法,結(jié)合差異代謝物動態(tài)行為分析,開展了Walker256腫瘤模型的代謝組學研究,以尋找與腫瘤密切相關(guān)的生物標志物。在腫瘤的代謝組學研究中,生物標志物的動態(tài)變化趨勢應與腫瘤的發(fā)展過程密切

6、相關(guān),因此,本研究對差異代謝物在腫瘤發(fā)展過程中的動態(tài)變化行為進行了細致考察,其結(jié)果發(fā)現(xiàn)了變化趨勢為含量先上升后下降或含量一直上升的差異代謝物,它們分別源于腫瘤的生長和荷瘤動物身體狀態(tài)的變化,其反映了腫瘤的生長和發(fā)展進程,則可以確認為與腫瘤密切相關(guān)的重要生物標志物。本研究共獲得了47個可能生物標志物并鑒定出15個標志物的結(jié)構(gòu),包括12個L-肉堿及其衍生物,2個氨基酸衍生物和1個核苷。生物學意義分析表明這些代謝物的異常可能預示著腫瘤大鼠體內(nèi)

7、發(fā)生的代謝紊亂,包括腫瘤細胞的快速復制,脂肪酸的β-氧化的下調(diào)和免疫力的下降等。目前,本研究已發(fā)現(xiàn)上述可能生物標志物在腫瘤發(fā)展過程中均呈現(xiàn)規(guī)律性的動態(tài)變化,則它們的含量變化可以實時監(jiān)測Walker256腫瘤的進程,有望為人類癌癥進程的監(jiān)測提供重要參考。
　　 此外,本研究將代謝相關(guān)性網(wǎng)絡分析應用于生物標志物的結(jié)構(gòu)鑒定及其生物學意義分析中,并充分挖掘可能生物標志物之間的相關(guān)性。同時,結(jié)合代謝途徑分析,考察推斷了與疾病相關(guān)且發(fā)生紊亂

8、的代謝途徑,從而為腫瘤發(fā)生、發(fā)展機制提供重要依據(jù)。
　　 3.基于Walker256腫瘤模型的藥物代謝組學方法研究
　　 本研究在上述研究的基礎上,采用代謝組學的研究思路,以給予HCPT的正常大鼠Walker256腫瘤模型大鼠尿液樣本為研究對象,建立了藥物代謝組學分析方法,開展了健康動物與腫瘤模型動物的藥物體內(nèi)代謝過程以及藥物引起內(nèi)源性代謝物變化的研究。通過對給予高、低劑量HCPT的正常大鼠與Walker256腫瘤大鼠尿

9、液樣本的系統(tǒng)比較分析,結(jié)果尋找到HCPT原形及其葡萄糖醛酸結(jié)合物,并分析考察了因給藥時間、劑量和病理狀態(tài)不同引起的代謝變化情況。其次,分別從高、低劑量給藥組和不給藥組的共同差異代謝物中獲得了14個與HCPT毒性、藥效作用相關(guān)的內(nèi)源性代謝物；此外,從已發(fā)現(xiàn)的可能生物標志物中篩選出6個更可靠的生物標志物和3個HCPT敏感性標志物。上述研究結(jié)果表明,采用本研究思路建立的藥物代謝組學研究方法,不僅可獲得藥物體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化以及與藥物毒性和藥效作用相

10、關(guān)的信息,而且能進一步篩選出更可靠的生物標志物及藥物敏感性標志物。本研究方法有望為藥物研究提供新的研究思路及途徑。
　　 4.代謝組學尿液分析的校正方法考察
　　 在基于質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學研究中,選擇一個理想的尿液校正方法很為必要,然而尿液校正效果缺少統(tǒng)一的評價標準,則難以評價尿液校正方法的優(yōu)劣。本研究首先采用連續(xù)稀釋的尿液樣本,對常用尿液校正方法的校正效果進行了考察,力求獲得最佳的校正方法；其次,以腫瘤接種前后的大鼠尿