基于GC-MS的代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)急性百草枯中毒大鼠的血漿代謝組學(xué)研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)的代謝組學(xué)研究百草枯中毒后大鼠的血漿代謝組學(xué)，觀察急性百草枯中毒后不同時(shí)間段大鼠的一般情況。通過(guò)多種多元統(tǒng)計(jì)分析方法分析血漿代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，篩選出急性百草枯中毒的潛在生物標(biāo)志物，尋找這些潛在生物標(biāo)記物的生物學(xué)意義，并探討百草枯中毒與這些潛在生物標(biāo)志物的聯(lián)系，為研究百草枯中毒的早期病情變化及發(fā)病機(jī)制提供新的思路。
　　方法：⑴將適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，斷食24小時(shí)的24只SD大鼠，按隨機(jī)

2、數(shù)字表法分為染毒組及對(duì)照組，每組12只。染毒組大鼠予以100mg/Kg的20％百草枯溶液一次性灌胃，對(duì)照組予以等量生理鹽水灌胃，于灌胃后2、24、48小時(shí)連續(xù)觀察大鼠一般情況及生命體征;按規(guī)定時(shí)間點(diǎn)收集大鼠腹主動(dòng)脈血樣后將大鼠處死。⑵由于百草枯性質(zhì)比較穩(wěn)定、沸點(diǎn)高、不宜揮發(fā)，而GC-MS所能檢測(cè)的成分必須具有揮發(fā)性，所以加用一種合適的肟化-硅烷化來(lái)行衍生化預(yù)處理，使百草枯中毒大鼠血漿中的代謝物能被GC-MS提取和分析。通過(guò)對(duì)監(jiān)測(cè)離子行專

3、屬性掃描以及混合標(biāo)準(zhǔn)品樣本中各標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)含量的RSD值完成了方法學(xué)上的考察。結(jié)合NIST05標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)和標(biāo)準(zhǔn)品完成內(nèi)源性代謝物的定性分析，采用和相同色譜圖中的內(nèi)標(biāo)物相比較的歸一化峰面積方法完成半定量分析。⑶血漿樣品經(jīng)肟化-硅烷化預(yù)處理后，經(jīng)氣相色譜標(biāo)準(zhǔn)EI電子源分離后，進(jìn)行質(zhì)譜全掃描分析，采集樣品中所有可檢測(cè)到的血漿化合物數(shù)據(jù)。通過(guò)主成分分析法(PCA)、偏最小二乘判別方法(PLS-DA)、隨機(jī)森林(RF)對(duì)血漿代謝物行代謝輪廓分析，并

4、進(jìn)一步使用RF分析法篩選出與百草枯中毒有關(guān)的潛在生物標(biāo)志物。
　　結(jié)果：①12只按隨機(jī)數(shù)字表選出的染毒組大鼠在灌胃后均未出現(xiàn)口鼻部百草枯溶液溢出或嗆咳，提示灌胃染毒成功。染毒組大鼠灌胃中毒后2小時(shí)逐漸表現(xiàn)出少動(dòng)、腹部抽動(dòng)、呼吸急促等中毒癥狀，24h時(shí)癥狀逐漸加重，精神變差，神情呆滯，至48h時(shí)大鼠除反應(yīng)、進(jìn)食進(jìn)一步變差，還出現(xiàn)呼吸費(fèi)力、肺部明顯的濕噦音、鼻部泡沫樣液體溢出等癥狀;對(duì)照組大鼠則生命體征平穩(wěn)，無(wú)不適癥狀。②選擇了大鼠血

5、漿代謝物檢測(cè)中必然會(huì)添加的內(nèi)標(biāo)戊五醇碎片離子峰73(m/z)作為監(jiān)測(cè)離子以行專屬性掃描，提高檢測(cè)代謝物的準(zhǔn)確性和靈敏性。13種混合標(biāo)準(zhǔn)品中各標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)含量RSD值均小于20％，且得到了很好的分離，出峰時(shí)間及面積穩(wěn)定，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)方法可靠，儀器運(yùn)行穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可用于后續(xù)的分析。③結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品、NIST05質(zhì)譜庫(kù)對(duì)大鼠百草枯中毒血清內(nèi)源性代謝物進(jìn)行定性，共定性出27種代謝物，其中的13種用對(duì)照品進(jìn)行定性，包括匹配度小于80％的血漿代謝物。另

6、外14個(gè)在NIST105質(zhì)譜庫(kù)中檢索。這27種代謝物中包括氨基酸、有機(jī)酸、糖類、脂肪酸以及膽固醇。④結(jié)合PCA及PLS-DA模型圖判別及RF的多維尺度變換圖，得出中毒組不同時(shí)間段大鼠血漿代謝分布較分散，而對(duì)照組分布比較密集，說(shuō)明兩組體內(nèi)產(chǎn)生的代謝模式不同;而且染毒組大鼠灌胃2h起代謝軌跡較對(duì)照組偏移明顯，至48 h時(shí)其軌跡又與24小時(shí)組產(chǎn)生了進(jìn)一步差距，表明大鼠在中毒早期血漿代謝產(chǎn)物已發(fā)生明顯差異且可被代謝組學(xué)檢測(cè)并形象體現(xiàn)出。⑤采用隨

7、機(jī)森林從27種定性出的代謝物中篩選出5種權(quán)重較大的潛在生物標(biāo)志物，分別為絲氨酸、棕櫚酸、硬脂酸、天冬酰胺、花生四烯酸，主要干擾大鼠體內(nèi)的能量代謝及脂質(zhì)代謝。
　　結(jié)論：⑴百草枯在肟化-硅烷化以衍生處理后可用于GC-MS代謝組學(xué)研究，能夠得出穩(wěn)定的代謝圖譜，克服數(shù)據(jù)在采集時(shí)本身存在的一定缺陷。⑵通過(guò)代謝組學(xué)方法，篩選出5種與百草枯中毒有關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，通過(guò)觀察大鼠中毒后的不同時(shí)間毒性表現(xiàn)變化及對(duì)應(yīng)時(shí)段代謝圖譜的變化，可在一定程度