肝硬化模型比較蛋白質組學研究及扶正化瘀方對血漿蛋白質組影響.pdf

1、第一部分: 肝硬化模型肝組織比較蛋白質組學研究 研究背景與目的：肝硬化是臨床常見的慢性進行性肝病，是我國疾病防治的主要任務之一。肝纖維化是肝硬化發(fā)展的必經病理過程。蛋白質組學應用各種技術手段從整體角度分析蛋白質組成、表達水平與修飾狀態(tài)的動態(tài)變化，了解蛋白質之間的相互作用與聯系，揭示蛋白質功能與細胞生命活動規(guī)律。 疾病蛋白質組學為探討疾病的發(fā)病機制、預防、早期診斷和治療提供重要理論基礎。本實驗構建CCl<,4>誘導大鼠肝硬化模型

2、，建立肝組織蛋白質組研究的技術平臺；掌握進行大鼠肝組織雙向凝膠電泳所需要的各種條件；了解CCl<,4>誘導大鼠肝硬化模型肝組織蛋白質組變化，為進一步研究肝纖維化、肝硬化發(fā)病機制奠定基礎。 方法：將雄性S-D大鼠隨機分成3組：正常對照組(n=6)給予橄欖油腹腔注射；肝硬化模型組(n=10)用CCl<,4>(CCl<,4>／橄欖油：v／v=1／1)按1ml／kg腹腔注射，每周2次，共8周誘導肝硬化模型。病理組織學觀察肝纖維化嚴重程度

3、并評分，用Masson三色染色法進行膠原染色。計數肝竇內α-SMA陽性細胞數觀察肝星狀細胞的活化情況。對肝組織進行雙向凝膠電泳，應用PDQUST圖像分析軟件將肝硬化模型組與對照組肝組織2-DE膠圖進行匹配，不同膠匹配點相對含量差異2倍及其以上的點為差異蛋白質點。對差異蛋白質點進行膠內消化、MALDI-TOF-TOF-MS質譜儀鑒定和數據庫搜索確定差異蛋白質。用免疫印跡法驗證雙向凝膠電泳質譜技術鑒定的蛋白質表達改變。 結果：肝硬化

4、模型組肝組織病理均提示典型纖維間隔和假小葉形成，α-SMA陽性細胞表達明顯增加。肝組織雙向電泳凝膠重復性滿意，顯示的蛋白斑點在分布、背景等方面基本一致。通過PDQtJST軟件分析的差異蛋白質點經膠內消化、質譜鑒定、蛋白質數據庫搜索有33個點得到鑒定，分別屬于28種蛋白質。在這些差異蛋白質中，有5種蛋白質僅在肝硬化模型組中出現；2種蛋白質僅在正常組出現；12種蛋白質在肝硬化模型組上調，9種蛋白質下調。這些蛋白質按其功能特性可分為與細胞增殖

5、、能量代謝相關酶類、物質代謝和轉運相關蛋白、細胞骨架和運動相關蛋白、氧化應激、內質網應激和熱休克相關蛋白質。免疫印跡法進一步證實了蛋白質組技術顯示的alpha crystallin B chain變化趨勢。 結論：成功構建肝硬化大鼠動物模型。利用蛋白質組學技術，從整體角度將蛋白質變化綜合一起，得到CCl<,4>誘導肝硬化大鼠肝組織蛋白質組的特征性變化。在CCl<,4>誘導大鼠肝硬化形成過程中，肝組織中差異表達的蛋白質可能通過影

6、響細胞增殖、能量代謝、物質轉運代謝、細胞骨架形成和運動、應激反應等參與、反映肝硬化的發(fā)生發(fā)展過程。 第二部分:肝硬化模型血漿比較蛋白質組學研究研究 背景與目的：許多疾病可導致血漿中多種蛋白質改變，這種特征性變化對疾病診斷和療效監(jiān)測具有重要意義。迄今為止人類僅對少數血漿蛋白作為臨床常規(guī)監(jiān)測用于某些疾病的診斷。血漿蛋白質組的發(fā)展拓寬了對血漿蛋白質的認識。全面而系統(tǒng)地認識肝纖維化和肝硬化時血漿蛋白改變情況，將有助于肝纖維化、肝

7、硬化的發(fā)病機制、診斷和藥效研究。本實驗將初步建立血漿蛋白質組技術平臺；掌握去除大鼠血漿白蛋白和球蛋白的方法以及進行血漿雙向凝膠電泳所需要的各種條件；了解CCl<,4>誘導大鼠肝硬化疾病模型的血漿蛋白質組變化，為進一步研究肝硬化的發(fā)病機制和診斷奠定基礎。方法：用CCl<,4>制備肝硬化動物模型，單純橄欖油腹腔注射組作為對照組。造模8周后抽取血液，同組間血漿混勻，去除血漿中白蛋白和球蛋白。進行雙向凝膠電泳，應用PDQUST圖像分析軟件對各種

8、條件下除血漿白蛋白和球蛋白的效果進行評價。將肝硬化模型組與對照組血漿2-DE膠圖進行匹配，不同膠匹配點相對含量的差異2倍及其以上的點為差異蛋白質點。對差異蛋白質點進行膠內消化、MALDI-TOF-TOF-MS質譜儀鑒定和數據庫搜索鑒定差異蛋白質。用免疫印跡法驗證雙向凝膠電泳質譜技術所鑒定的蛋白質表達改變。 結果：使用Albumin/IgG Removal Kit可去除血漿中大部分白蛋白和球蛋白。去除后，雙向凝膠電泳顯示的蛋白質斑

9、點由處理前的260±15個增加到598±42個。膠重復性滿意，顯示蛋白斑點在分布、背景等方面基本一致。通過PDQUST軟件分析的差異蛋白質點經膠內消化、質譜鑒定、蛋白質數據庫搜索有20個點得到鑒定，分別屬于16種蛋白質：血漿谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽過氧化物酶前體、載脂蛋白A-IV前體、載脂蛋白E、結合珠蛋白、前白蛋白、血漿視黃醇結合蛋白、α1-抗胰蛋白酶、微管相關調節(jié)激酶1、α1-巨球蛋白、補體4、α抑制劑H4重鏈、轉鐵蛋白、肝臟再

10、生相關蛋白、波形纖維蛋白和RIKEN eDNAl700025816。免疫印跡法進一步證實了蛋白質組研究顯示的結合珠蛋白變化趨勢。 結論：去除大鼠血漿中的白蛋白和球蛋白可明顯增加雙向凝膠電泳蛋白質點的顯示，優(yōu)化了血漿2-DE圖譜。本研究建立的血漿蛋白質組研究平臺可用于疾病機制的研究。CCl<,4>誘導大鼠肝硬化模型血漿中細胞防御和免疫相關蛋白質、物質轉運蛋白質、細胞骨架和轉化調控蛋白、急性時相反應蛋白等在表達量上不同程度地發(fā)生了

11、變化，提示這些蛋白質表達改變可能與肝硬化的發(fā)病機制有關，反映了肝硬化時血漿蛋白質的整體改變。 第三部分:扶正化瘀方干預肝硬化大鼠血漿比較蛋白質組研究研究 背景與目的：運用蛋白質組學方法，分析中藥復方對CCl<,4>誘導肝纖維化、肝硬化大鼠血漿與正常血漿蛋白質組差異表達，以期篩選出與藥物作用相關的差異蛋白質，為肝纖維化、肝硬化的藥物治療機制和療效評價提供依據。目前扶正化瘀方在治療肝炎后肝硬化及慢性乙型肝炎肝纖維化方面取得良

12、好的臨床效果，其抗肝纖維化作用機制是多方面的，具有復方中藥的多成分、多環(huán)節(jié)、多層次、多靶點作用特點，蛋白質組學為從整體水平研究扶正化瘀方開辟了新途徑。以CCl<,4>大鼠肝纖維化模型作為研究對象，探討肝纖維化過程中血漿蛋白質組表達改變，揭示扶正化瘀方對肝纖維化多途徑作用機制及其療效評價。 方法：將雄性S-D大鼠隨機分為三組，正常對照組(n=6)給予橄欖油腹腔注射；肝硬化模型組(n=10)給予CCl<,4>(CCl<,4>/橄欖油

13、：v/v=1/1)按1ml/kg腹腔注射，每周2次，共8周誘導肝硬化模型；扶正化瘀方組(n=10)在CCl<,4>腹腔注射同時給予扶正化瘀方灌胃。8周后通過Masson三色染色法用圖像分析儀自動分析肝臟膠原面積。應用雙向凝膠電泳技術經銀染顯色和PDQUST7.3軟件分析凝膠圖像，對三組中表達均有差異的蛋白質點用基質輔助激光解吸電離飛行時間串連質譜進行鑒定。 結果：扶正化瘀方干預組較模型組肝纖維化程度明顯減輕，膠原纖維在肝內沉積減

14、少(8.9％±3.7％vs．12.4％±4.7％，P<0.05)。實驗去除血漿中的高豐度蛋白質可獲得重復性較好的血漿蛋白質圖譜。共鑒定出10個明顯差異表達的蛋白質。在這些蛋白質中，血漿谷胱甘肽過氧化物酶及其前體、前白蛋白、結合珠蛋白、載脂蛋白A-IV前體、補體4、α抑制劑H4重鏈和微管相關調節(jié)激酶1在肝硬化大鼠血漿中表達減少，扶正化瘀方干預組表達增加，肝臟再生相關蛋白和波形纖維蛋白在肝硬化大鼠血漿中表達增加，扶正化瘀方干預組表達減少。