重癥肌無(wú)力胸腺組織比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的：建立分辨率高和重復(fù)性好的重癥肌無(wú)力(myasthenia gravis，MG)患者及正常胸腺組織蛋白質(zhì)的雙向凝膠電泳圖譜，比較二者蛋白質(zhì)組，篩選并鑒定MG胸腺組織異常表達(dá)蛋白。 方法： 1 分別以尿素、硫脲、CHAPS、PMSF為主要成分的樣品裂解液和蛋白純化試劑盒兩種方法提取7例正常人和21例MG患者胸腺組織蛋白質(zhì)，并用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，然后分裝凍存。 2 以17cmpH3-10固相pH梯度

2、膠條(immobilized pH gradiednt，IPG)做第一向IEF，12％SDS聚丙烯酰胺凝膠為第二向進(jìn)行雙向電泳(2-D)，PDQuest7.1軟件分析電泳圖譜的重復(fù)性，評(píng)價(jià)分別由樣品裂解液和蛋白純化試劑盒兩種不同胸腺組織蛋白提取方法。 3 利用PDQuest7.1軟件，比較MG患者及正常胸腺組織蛋白質(zhì)的雙向凝膠電泳圖譜，篩選異常表達(dá)蛋白，胰蛋白酶進(jìn)行膠內(nèi)原位酶解，經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-

3、associated laser desorption/ionization time of flight massspectrometry， MALDI-TOF-MS)分析得到肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide massfingerprinting，PMF)和數(shù)據(jù)。 4 登陸網(wǎng)站。http：//www．matrixscience．com，用Mascot程序檢索NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定蛋白質(zhì)。 結(jié)果： 1 采用樣品裂

4、解液法的胸腺組織蛋白雙向電泳圖譜圖像分析后可檢測(cè)到176±7個(gè)蛋白點(diǎn)，而采用蛋白純化試劑盒純化后可檢測(cè)到279±9個(gè)蛋白點(diǎn)。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，純化試劑盒純化后凝膠圖像縱條紋、橫條紋以及背景都明顯減少，使能夠檢測(cè)的到的蛋白點(diǎn)數(shù)量明顯增加。 2 凝膠圖像蛋白質(zhì)點(diǎn)在位置上有較好的重復(fù)性，在IEF方向的平均偏差為(0.86±0.8)mm，SDS-PAGE方向的平均偏差為(0.48±0.21)mm，由此獲得了分辨率、重復(fù)性均較高的MG與正常胸腺組

5、織的雙向凝膠電泳圖譜。 3 從MG增生型胸腺組織中共篩選出9個(gè)異常表達(dá)的蛋白點(diǎn)。 4 異常表達(dá)的蛋白點(diǎn)經(jīng)膠內(nèi)酶解．質(zhì)譜指紋圖分析，獲得了9張肽質(zhì)量指紋圖譜，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢分析，其中蛋白點(diǎn)4，5，7，10，11，12，18號(hào)得到鑒定，分別為F-actin capping protein alpha-1 subunit、L-lactate dehydrogenase B chain、Chain，Annexln V、Chain

6、A，14-3-3 Protein EpsiIon、chloride intracellular channel 1、ACTBprotein、gamma-actin，其余2個(gè)蛋白點(diǎn)未得到鑒定。結(jié)論： 1 采用蛋白純化試劑盒提取胸腺組織蛋白，能夠獲得背景清晰、蛋白質(zhì)點(diǎn)較多的二維凝膠圖像，蛋白質(zhì)點(diǎn)重復(fù)性分析表明該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)是穩(wěn)定的，為下一步胸腺組織蛋白質(zhì)組學(xué)的研究打基礎(chǔ)。 2 經(jīng)對(duì)MG患者和正常胸腺組織比較蛋白質(zhì)學(xué)研究，得到9個(gè)