蘿卜硫素對高糖誘導小鼠海馬神經(jīng)元凋亡的保護作用及相關機制研究.pdf

1、糖尿病(Diabetes mellitus，DM)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響已引起人們的廣泛重視，由于DM本身的代謝絮亂和微血管病變所致的大腦功能異常，糖尿病腦病(Diabetic encephalopathy,DE)也是糖尿病的主要并發(fā)癥之一。高糖(High glucose，HG)導致的內質網(wǎng)應激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）在DE的發(fā)生發(fā)展過程中起到了關鍵性作用。蘿卜硫素（Sulforaphane，S

2、F）是西蘭花等十字花科蔬菜中的提取物，對癌癥、神經(jīng)退行性病變及糖尿病等多種慢性疾病具有一定療效。本文通過離體HG培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元模擬在體情況和建立1型糖尿病(T1D)小鼠模型，探討HG對海馬神經(jīng)元ERS發(fā)生發(fā)展的影響，并研究SF對糖尿病海馬神經(jīng)元的保護作用及可能的機制，為臨床預防和治療DE提供新的理論依據(jù)。
　　第一部分 蘿卜硫素抑制高糖誘導小鼠原代海馬神經(jīng)元內質網(wǎng)應激依賴的凋亡
　　目的:
　　通過體外原代培養(yǎng)小鼠

3、海馬神經(jīng)元，探討HG對海馬神經(jīng)元ERS發(fā)生發(fā)展的影響，并研究SF在HG誘導海馬神經(jīng)元ERS中的作用及可能的機制。
　　方法:
　　1.提取并原代培養(yǎng)新生24h昆明小鼠海馬神經(jīng)元，倒置顯微鏡觀察神經(jīng)元形態(tài)結構，用神經(jīng)元NeuN抗體對海馬神經(jīng)元進行鑒定。
　　2.用CCK-8法篩選HG作用濃度和SF作用濃度。
　　3.實驗分為正常組(NC)、高糖處理組(HG)、高糖處理+蘿卜硫素預處理組(HG+SF)，HG作用12h

4、或72h后，收取細胞。
　　4.原位末端轉移酶標記法（TUNEL）檢測各組細胞凋亡。
　　5.免疫熒光檢測各組細胞GRP78蛋白表達。
　　6.通過Real time PCR和Western Blot技術，檢測各組細胞GRP78、ATF6、P-JNK、JNK、Caspase-12基因及蛋白的表達。
　　結果:
　　1.小鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)至6天時，神經(jīng)元胞體豐滿，突起延長，交織成網(wǎng)絡。用神經(jīng)元NeuN抗體

5、對海馬神經(jīng)元進行鑒定，神經(jīng)元純度達90％以上，可以用于后續(xù)實驗。
　　2.用不同濃度的HG處理神經(jīng)元24h后，60mM HG濃度能使神經(jīng)元活性明顯降低，并有顯著性差異(P＜0.05);不同濃度的SF處理神經(jīng)元24h后，發(fā)現(xiàn)2.5μM以上濃度對細胞存在明顯毒性，參考以前文獻，選擇0.5μM SF應用于后續(xù)的實驗。
　　3.TUNEL染色證實，TUNEL陽性細胞呈綠色斑點狀。與NC組相比，HG誘導12h組TUNEL陽性細胞增多(

6、P＜0.05)，誘導72h組TUNEL陽性細胞明顯增多(P＜0.01);與HG組比較，SF組陽性細胞在12h、72h均明顯減少(P＜0.05，P＜0.01)。
　　4.免疫熒光結果顯示，GRP78表達于胞漿，呈綠色熒光。與NC組比較，HG誘導細胞12h組GRP78表達明顯增加，誘導72h組則表達減少;與HG組比較，SF處理組GRP78在12h時表達減少，在72h時表達增加。
　　5.SF對HG誘導海馬神經(jīng)元ERS及相關信號通

7、路蛋白表達的影響，結果顯示，與NC組相比，HG誘導細胞12h組，GRP78、ATF6蛋白表達水平明顯上調(P＜0.05，P＜0.05)，誘導72h組又表達下調(P＜0.001，P＜0.01);與HG組相比，SF處理組在12h時GRP78、ATF6蛋白的表達降低(P＜0.05，P＜0.05)，在72h時表達增加(P＜0.05，P＜0.05)。HG誘導細胞12h、72h組與相應NC組比較，P-JNK蛋白均有不同程度上調(P＜0.001，P＜

8、0.01);而與HG組相比，SF處理組P-JNK蛋白在12h、72h均表達下調(P＜0.05，P＜0.01)。
　　6.SF對HG誘導海馬神經(jīng)元CHOP基因表達水平的影響，結果表明，NC組、HG誘導12h組以及SF預處理組之間CHOP基因表達水平無明顯變化，HG誘導72h組CHOP基因表達與NC組比較顯著上調(P＜0.01)，而SF處理組與HG組相比在72h時表達明顯降低(P＜0.05)。
　　第二部分 蘿卜硫素對1型糖尿病

9、小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的保護作用及相關機制研究
　　目的:
　　通過建立T1D小鼠模型，進一步探討隨著時間延長，海馬區(qū)神經(jīng)元內ERS的變化，研究SF和硫氧還蛋白(Trx)抑制劑(PX12)處理T1D小鼠后，對海馬區(qū)神經(jīng)元ERS的影響，明確SF對T1D小鼠海馬神經(jīng)元保護的機制，為臨床預防和治療糖尿病腦病提供關鍵靶點和新的理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.采用鏈脲佐菌素(STZ)注射的方法建立T1D小鼠模型。實驗分成正常組(

10、NC)、糖尿病組(T1D)、蘿卜硫素預處理組(T1D+SF)、蘿卜硫素+PX12預處理組(T1D+SF+PX12)。分別在造模成功第1天(1d)、3天(3d)、1周(1w)、2周(2w)、4周(4w)記錄各組血糖變化，并取相應小鼠大腦及海馬區(qū)組織。
　　2.TUNEL技術原位檢測各組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡。
　　3.取小鼠海馬區(qū)組織，電鏡觀察各組海馬區(qū)神經(jīng)元超微結構。
　　4.通過Real time PCR和Wester

11、n Blot技術，檢測各組小鼠海馬區(qū)ERS和相關信號通路基因蛋白的表達。
　　5.免疫組織化學技術檢測各組小鼠海馬區(qū)中GRP78、CHOP蛋白的表達。
　　結果:
　　1.小鼠血糖的變化。與NC組相比，T1D、T1D+SF和T1D+SF+PX12組血糖在1d、3d時均明顯升高，1w時達到最高值，并在2w、4w時基本保持不變;T1D、T1D+SF、T1D+SF+PX12組之間血糖無明顯差異。
　　2.TUNEL陽性

12、信號呈綠色斑點呈現(xiàn)于細胞核。與NC組相比，T1D組小鼠海馬區(qū)TUNEL陽性細胞在1d時數(shù)量增加(P＜0.05)，4w時陽性細胞明顯增加(P＜0.001);SF處理組與T1D組比較，在1d、4w時TUNEL陽性細胞均顯著減少(P＜0.05，P＜0.001);SF和PX12聯(lián)合處理組與T1D+SF組比較，TUNEL陽性細胞在1d、4w時增加，其中4w時有顯著性差異(P＜0.01)。
　　3.小鼠海馬區(qū)超微結構在4w時顯示，NC組細胞核

13、呈橢圓形，核膜完整，內質網(wǎng)排列致密、連貫，細胞內線粒體結構正常;T1D組內質網(wǎng)擴張，連貫性破壞，部分線粒體腫脹，嵴減少，形成較寬的電子透亮區(qū)，出現(xiàn)空泡化;T1D+SF組內質網(wǎng)、線粒體的擴張和腫脹得到明顯改善;T1D+SF+PX12組則與T1D組相似，同樣出現(xiàn)了擴張的內質網(wǎng)，線粒體有輕度損傷。
　　4.GRP78蛋白在T1D小鼠海馬區(qū)不同時間點表達結果顯示，T1D1d、3d、1w、2w組GRP78蛋白表達水平均高于NC組，1d組表達

14、最高(P＜0.01)，T1D4w組GRP78表達水平低于NC組(P＜0.05)。
　　5.SF和PX12對T1D小鼠1d和4w時海馬區(qū)ERS相關蛋白表達的影響，結果顯示，與NC組相比，T1D組在1d時Trx-1蛋白表達水平無明顯變化，4w時表達水平明顯下調(P＜0.05);SF處理組與T1D組比較，在1d和4w時Trx-1表達均顯著增加(P＜0.01，P＜0.05);SF和PX12聯(lián)合處理組與T1D+SF組相比，Trx-1在1d和

15、4w時表達明顯減少(P＜0.05，P＜0.05)。T1D組與NC組比較，ERS相關蛋白GRP78、ATF6在1d時均表達上調(P＜0.001，P＜0.05)，4w又表達下調(P＜0.01，P＜0.05);與T1D組比較，SF處理組GRP78、ATF6在1d表達減少(P＜0.01，P＜0.01)、4w表達增加(P＜0.05，P＜0.05);SF和PX12聯(lián)合處理組與T1D+SF組比較，GRP78、ATF6在1d表達增加(P＜0.05，P＜

16、0.05),4w表達減少(P＜0.05，P＜0.05)。
　　結論:
　　1.HG誘導了海馬神經(jīng)元ERS的發(fā)生與發(fā)展，最終導致了細胞的凋亡，SF的應用能明顯改善HG觸發(fā)的小鼠海馬神經(jīng)元ERS及細胞凋亡情況。
　　2.在小鼠T1D模型中，ERS相關蛋白GRP78、ATF6在T1D早期表達上調，隨著時間延長，第4周表達下調，可能與過度的ERS有關。
　　3.SF可能通過作用于Trx這一關鍵靶點，抑制ERS中CHOP-