腺病毒介導(dǎo)人β-,2--腎上腺素受體在兔慢性缺氧心肌細(xì)胞的表達(dá)及細(xì)胞保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 通過腺病毒介導(dǎo)的β2-腎上腺素受體(β2-AR)基因轉(zhuǎn)染紫紺型心臟病動物模型(CCM)兔心肌細(xì)胞，探討β2-AR基因轉(zhuǎn)染對慢性缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。 方法： 1.重組Ad.β2-AR腺病毒擴(kuò)增： 采用50％組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID50)測定病毒滴度，熒光顯微鏡檢測病毒轉(zhuǎn)染率，Western blot檢測HEK293細(xì)胞中β2-AR蛋白表達(dá)。 2.建立紫紺型心臟病動物模型： 采

2、用外科手術(shù)的方法，將成年新西蘭大白兔的主肺動脈與左心耳吻合，建立右向左分流紫紺型心臟病動物模型。 3.分離培養(yǎng)心肌細(xì)胞及β2-AR基因轉(zhuǎn)染： 應(yīng)用Langendorff逆向灌注膠原酶消化，分離成年兔心肌細(xì)胞，進(jìn)行體外原代培養(yǎng)。心肌細(xì)胞分為5組：①正常組(Control)：分離正常成年兔心肌細(xì)胞，培養(yǎng)48h。②假手術(shù)組(Sham)：分離假手術(shù)組兔心肌細(xì)胞，培養(yǎng)48h。⑧紫紺型心臟病模型組(CCM)：分離紫紺型動物模型兔心肌

3、細(xì)胞，培養(yǎng)48h。④轉(zhuǎn)GFP組(Ad.GFP)：分離紫紺型動物模型，轉(zhuǎn)染GFP基因的心肌細(xì)胞，培養(yǎng)48h。⑤轉(zhuǎn)β2-AR組(Ad.β2-AR)：分離紫紺型動物模型，轉(zhuǎn)染β2-AR基因心肌細(xì)胞，培養(yǎng)48h。 4.Ad.β2-AR轉(zhuǎn)染細(xì)胞保護(hù)作用檢測 Western blot檢測實(shí)驗(yàn)各組心肌細(xì)胞中β2-AR蛋白表達(dá)；檢測Caspase-3蛋白、p-AKT和p-ERK的蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 1.擴(kuò)增后Ad.GFP

4、滴度為3.16×1010pfu/ml，Ad.β2-AR滴度為3.98x1010pfu/ml。Western Blot測定顯示，HEK293細(xì)胞感染Ad.β2-AR后，β2-AR蛋白表達(dá)為對照組的5.6倍。 2.建模5周后，動脈血?dú)夥治鰷y定顯示，紫紺型兔動物模型PO2(45.3±3.7)及SaO2(75.7±6.5)均較正常兔顯著降低(P<0.01)。 3.Ad.β2-AR轉(zhuǎn)染紫紺型動物模型兔心肌細(xì)胞，培養(yǎng)48h病毒感染率

5、最高。與紫紺組相比，轉(zhuǎn)β2-AR組心肌細(xì)胞存活率顯著升高(35.36±6.35 vs 44053±6.67)(P<0.01)。 4.Western Blot測定顯示，轉(zhuǎn)β2-AR基因組β2-AR蛋白表達(dá)高于紫紺組約3倍(P<0.01)；p-AKT和p-ERK蛋白表達(dá)較紫紺組增加約2倍，Caspase-3蛋白表達(dá)為紫紺組0.65倍；轉(zhuǎn)β2-AR組β2-AR蛋白表達(dá)與正常組及假手術(shù)組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。