腺病毒介導(dǎo)的HIF-1α基因?qū)π募〖?xì)胞缺血再灌注保護(hù)作用的實驗研究.pdf

1、目 的：研究腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)低氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α， HIF-1α)基因?qū)ε囵B(yǎng)心肌細(xì)胞摸擬缺血再灌注(缺氧-復(fù)氧)損傷中的保護(hù)作用，并觀察其對熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitric oxide synthase，iNOS)、葡萄糖轉(zhuǎn)運子4(glucose transporter-4,GLUT-4)基因表達(dá)

2、的影響，初步探討其保護(hù)作用可能的分子機制。以腺病毒空載體及HIF-1α核酶基因進(jìn)行對比以證明HIF-1α在心肌細(xì)胞缺血再灌注中的保護(hù)作用。 方法：采用胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶聯(lián)合分次消化法分離新生Sprague-Dawley(S-D)大鼠心肌細(xì)胞，并進(jìn)行體外培養(yǎng)。攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)基因的腺病毒(Ad-GFP)按轉(zhuǎn)染倍數(shù)(MOI)25、50、100、200轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，倒置

3、熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)陽性的細(xì)胞評價轉(zhuǎn)染效率。心肌細(xì)胞隨機分為7組：A空白對照組(CONTROL組)，不轉(zhuǎn)基因不缺氧，常氧培養(yǎng)65h；B缺血再灌注組(I／R組)，不轉(zhuǎn)基因，摸擬缺血再灌注；C低氧預(yù)適應(yīng)組(IPC組)，低氧(1％O<,2>)3h后正常培養(yǎng)24h，摸擬缺血再灌注； D轉(zhuǎn)染HIF-1α基因1組(Ad HIF-1α1組，MOI 50)，轉(zhuǎn)HIF-1α基因48h后換培養(yǎng)液，摸擬缺血再灌注；E轉(zhuǎn)染HIF-1α基因2組(AdHIF

4、-1α2組，MOI 100)，轉(zhuǎn)HIF-1α基因48h后換培養(yǎng)液，摸擬缺血再灌注；F轉(zhuǎn)染腺病毒空載體組(Ad Blank組)，轉(zhuǎn)腺病毒空載體48h．后換培養(yǎng)液，摸擬缺血再灌注；G轉(zhuǎn)染HIF-1α核酶基因組(AtHIF-1α組)，轉(zhuǎn)：HIF-1α核酶基因48h后換培養(yǎng)液，摸擬缺血再灌注。完成缺氧、復(fù)氧過程后，取各組心肌細(xì)胞，MTS比色法檢測細(xì)胞活性；取細(xì)胞培養(yǎng)液比色法測乳酸脫氫酶(LDH)活性、超聲破碎細(xì)胞后硫代巴比妥酸顯色法測丙二醛(M

5、DA)含量；逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR法)測細(xì)胞內(nèi)HIF-1 α、GLUT-4、iNOS、HSP70mRNA表達(dá)情況。免疫印跡法(western-blot法)檢測細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 1、新生大鼠心肌細(xì)胞貼壁生長，呈梭形或多角形，95％細(xì)胞可見自律搏動，頻率40～130bpm，心肌細(xì)胞純度為90％。 2、Ad GFP轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞24h后鏡下可見綠色熒光蛋白表達(dá)，表達(dá)高峰在轉(zhuǎn)染后48h～5

6、d，轉(zhuǎn)染倍數(shù)(multiplicities of infection， MOI)50和100時，轉(zhuǎn)染效率分別為72.6％和95.2％，細(xì)胞免疫反應(yīng)小。 3、低氧預(yù)適應(yīng)C組較缺血再灌注b組細(xì)胞活性好(P<0.05)、 心肌細(xì)胞損傷性生化指標(biāo)LDH、MDA含量較低(P<0.05)，低氧時HIF-1amRNA表達(dá)與正常對照組無明顯差異(P<0.05)，HIF-α蛋白表達(dá)在缺血預(yù)適應(yīng)后短暫上升。GLUT-4、HSP70mRNA于低氧

7、后1h表達(dá)顯著上升持續(xù)至24h，iNOS mRNA于低氧后24h上升。 4、轉(zhuǎn)染HIF-1 α基因d組和e組較缺血再灌注b組、轉(zhuǎn)染腺病毒空載體f組和轉(zhuǎn)染HIF-1 α核酶基因g組細(xì)胞存活性(MTS法)、抗模擬缺血損傷能力強(P<0.05)，心肌細(xì)胞損傷性生化指標(biāo)LDH、MDA含量明顯減少(P<0.05)，e組與低氧預(yù)處理c組無顯著差異。 5、d組和e組GLUT-4、iNOS、HSP70 mRNA的表達(dá)均上增加且程濃度依賴

8、關(guān)系。 結(jié)論： 1.原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞，生長狀態(tài)良好，純度高。 2.腺病毒可有效轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率較高。 3.基因轉(zhuǎn)染造成的HIF-la高表達(dá)可有效保護(hù)心肌細(xì)胞抗模擬缺血再灌注損傷，并摸擬了低氧預(yù)適應(yīng)的晚期保護(hù)作用。腺病毒空載體及HIF-la核酶基因干預(yù)無細(xì)胞保護(hù)作用，證實HIF-la是抗缺血再灌注損傷的保護(hù)機制之一。 4.腺病毒介導(dǎo)的HIF-la基因轉(zhuǎn)染保護(hù)心肌細(xì)胞缺血再灌注保護(hù)作用