活細(xì)胞內(nèi)GLUT4囊泡納米級三維實(shí)時(shí)定位技術(shù)的研究.pdf

1、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）在肌肉細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取過程中起著重要作用。有研究表明，GLUT4響應(yīng)胰島素刺激向細(xì)胞膜募集，促進(jìn)細(xì)胞對葡萄糖的攝取。這一過程的失調(diào)與Ⅱ型糖尿病相關(guān)。研究活細(xì)胞內(nèi)GLUT4囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，可以進(jìn)一步加深對Ⅱ型糖尿病發(fā)病機(jī)理的研究，并尋找更有效的治療手段。由于三維單微粒定位技術(shù)的局限性以及所使用的熒光標(biāo)記物易于漂白且熒光強(qiáng)度相對較弱的缺陷，目前對GLUT4胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究僅局限于觀察GLUT4囊泡在

2、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的某些短時(shí)程或者局部區(qū)域的片段。在三維空間內(nèi)對GLUT4進(jìn)行長時(shí)程的實(shí)時(shí)定位，能夠?yàn)檠芯炕罴?xì)胞內(nèi)GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)過程提供新的證據(jù)。本文的目的就是研究和開發(fā)一種活細(xì)胞內(nèi)GLUT4囊泡納米級三維實(shí)時(shí)定位技術(shù)，為我們研究活細(xì)胞內(nèi)GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)提供新的手段。
　　本文利用量子點(diǎn)（QDs）標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)的GLUT4。由于QDs具有激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、熒光亮度高以及耐光漂白等優(yōu)點(diǎn)，所以標(biāo)記了QDs的GLUT4克服了傳統(tǒng)熒光標(biāo)記物熒

3、光圖像信噪比低及不能夠進(jìn)行長時(shí)程成像觀察的缺點(diǎn)。同時(shí)，利用熒光點(diǎn)離焦圖像與離焦距離的關(guān)系，可以設(shè)計(jì)單微粒納米級三維實(shí)時(shí)定位算法，構(gòu)建單微粒納米級三維實(shí)時(shí)定位系統(tǒng)。本文主要內(nèi)容如下：
　?。?）研究QDs標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)GLUT4的實(shí)驗(yàn)方法。通過一系列實(shí)驗(yàn)，我們利用調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度和試劑濃度的方法，標(biāo)記了活細(xì)胞表面的GLUT4，并觀察GLUT4在活細(xì)胞撤去胰島素刺激的狀態(tài)下胞吞進(jìn)入特定細(xì)胞器的過程。通過實(shí)驗(yàn)證明利用QDs標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)GLUT

4、4的實(shí)驗(yàn)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、光毒性小且容易被檢測的優(yōu)點(diǎn)。
　?。?）設(shè)計(jì)單微粒納米級三維實(shí)時(shí)定位算法。通過實(shí)驗(yàn)和計(jì)算，推導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)室所用熒光顯微成像系統(tǒng)中熒光點(diǎn)離焦圖像最外層圓環(huán)半徑與離焦距離的關(guān)系，并進(jìn)一步推導(dǎo)出利用離焦圖像最外層圓環(huán)半徑計(jì)算離焦距離的公式。繼而為實(shí)現(xiàn)單微粒納米級三維實(shí)時(shí)定位設(shè)計(jì)圖像處理算法，包括熒光圖像的預(yù)處理算法、通過迭代的質(zhì)心算法計(jì)算熒光點(diǎn)X-Y平面上的位置以及測量離焦圖像最外層圓環(huán)半徑以計(jì)算熒光點(diǎn)離