實(shí)時(shí)三維超聲激勵(lì)瘤內(nèi)注射微泡增強(qiáng)VX2移植瘤化療.pdf

1、腫瘤治療方法主要包括手術(shù)切除、放療、化療、介入治療、高強(qiáng)度聚焦超聲治療、射頻消融、激光治療等。化療為傳統(tǒng)治療的重要手段之一，具有以下獨(dú)特優(yōu)勢(shì):①作用于分裂期細(xì)胞，包括腫瘤干細(xì)胞，治療腫瘤原發(fā)病灶及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶;②降低機(jī)體免疫抑制。然而，化療療效受到某些因素的限制:①抗腫瘤藥物在腫瘤組織內(nèi)難以達(dá)到有效濃度;②靜脈給藥所致的全身不良反應(yīng)限制了給藥的劑量;③抗腫瘤藥物的半衰期一般較短，腫瘤組織內(nèi)難以穩(wěn)定地維持有效藥物濃度。因此，提高腫瘤局部藥物

2、濃度是化療的關(guān)健。
　　 大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，超聲激勵(lì)微泡“空化效應(yīng)”能夠提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，抑制瘤體生長(zhǎng)。超聲波輻照微泡，微泡發(fā)生振蕩、收縮、膨脹等一系列動(dòng)力學(xué)過(guò)程，即“空化效應(yīng)”;由此產(chǎn)生的微束流或沖擊波能使微泡周圍的細(xì)胞膜形成孔隙，即“聲孔效應(yīng)”，膜外的分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)?！奥暱仔?yīng)”又分為“可逆聲孔效應(yīng)”和“不可逆聲孔效應(yīng)”。
　　 治療超聲激勵(lì)微泡增強(qiáng)腫瘤化療已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道，很多學(xué)者探討了治療超聲聲強(qiáng)度、脈

3、沖方式、占空比、頻率、輻照時(shí)間等參數(shù)優(yōu)化問(wèn)題;評(píng)估微米級(jí)微泡、液—?dú)庀嘟晃⑴?、載藥微泡以及同時(shí)具備診斷和治療功能的微泡等對(duì)療效的影響;觀察不同腫瘤細(xì)胞和移植瘤模型的療效。
　　 二維診斷超聲激勵(lì)微泡也有文獻(xiàn)報(bào)道，適宜的機(jī)械指數(shù)(MI)、輻照時(shí)間，二維診斷超聲激勵(lì)微泡能夠在細(xì)胞膜上形成孔隙;增強(qiáng)微血管的通透性，紅細(xì)胞外溢，骨髓—間充質(zhì)干細(xì)胞也可以透過(guò)微血管壁至心梗部位誘導(dǎo)微血管新生。
　　 而實(shí)時(shí)三維超聲激勵(lì)微泡的實(shí)驗(yàn)研究

4、鮮有報(bào)道。
　　 離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，造影劑微泡直接混于腫瘤細(xì)胞懸液中，貼近細(xì)胞。在體實(shí)驗(yàn)，造影劑微泡采用經(jīng)靜脈注射途徑給予，微泡在微血管內(nèi)流動(dòng)，且受肺循環(huán)的影響。已有文獻(xiàn)證實(shí)，采用瘤內(nèi)注射途徑給予微泡聯(lián)合治療超聲輻照能夠增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)鑭顆粒數(shù)目;但透射電鏡圖顯示細(xì)胞內(nèi)鑭顆粒只有2個(gè)。
　　 臨床診斷超聲設(shè)備，超聲場(chǎng)的強(qiáng)度用機(jī)械指數(shù)(MI)表示，機(jī)械指數(shù)取決于峰值負(fù)壓的最大值(Pr)和聲場(chǎng)的中心頻率(f)。MI＜0.3，認(rèn)為聲

5、場(chǎng)強(qiáng)度是低的;0.3＜MI＜0.7，超聲波對(duì)新生的肺組織和腸管可能存在輕微的損傷;MI＞0.7，無(wú)論液體中是已否存在微氣泡，都有可能發(fā)生“空化效應(yīng)”，且這一可能性隨著MI值的增大而增大;臨床診斷超聲設(shè)備MI設(shè)置的上限為1.9。
　　 造影劑微泡——聲振方式制備的全氟丙烷人血白蛋白微球注射劑（“全氟顯”），人血白蛋白包裹核心氣體全氟丙烷制成平均直徑為2.5～4.0μm的微球混懸液。核心氣體全氟丙烷的血中溶解度非常低，因此氣體難于從

6、微球中擴(kuò)散至血液，全氟丙烷氣體可穩(wěn)定的存在于微球中隨血流流經(jīng)全身;當(dāng)采用經(jīng)兔耳緣靜脈注射的途徑給予“全氟顯”時(shí)，微球流經(jīng)肺循環(huán)，因全氟丙烷核心氣體的氣血分配系數(shù)非常大，按照亨利定律，一部分核心氣體全氟丙烷將會(huì)迅速?gòu)姆蚊?xì)血管進(jìn)入到大氣中，剩余一定比例的“全氟顯”跨肺進(jìn)入左心，隨血流流經(jīng)各臟器微循環(huán)實(shí)現(xiàn)該部位的超聲顯影。
　　 “全氟顯”在微血管內(nèi)循環(huán)時(shí)，由于其粒徑多在微米級(jí)，不能透過(guò)微血管壁進(jìn)入組織間隙，超聲和微泡的相互作用主要

7、發(fā)生在血管腔，以直接損傷血管內(nèi)皮為主。
　　 兔VX2腫瘤是由Shope病毒在兔皮膚上誘發(fā)產(chǎn)生的惡性乳頭狀瘤，經(jīng)72次傳代培養(yǎng)后正式建立命名為VX2，是一種可移植的廇株，無(wú)排斥反應(yīng)，可接種在兔的任何內(nèi)臟、骨骼及軟組織內(nèi)穩(wěn)定地生長(zhǎng)。兔VX2肌肉腫瘤模型與接種于肝、腎、骨骼、肺等部位的腫瘤模型相比具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì):①腫瘤位置表淺，可通過(guò)經(jīng)皮膚表面捫及的方式早期發(fā)現(xiàn)成瘤，可用于早期腫瘤治療的研究及療效評(píng)價(jià);而其他部位接種的腫瘤位置較深

8、，其觀察常需要借助影像學(xué)手段，也易受時(shí)間和空間的制約，致使發(fā)現(xiàn)成瘤的時(shí)間相對(duì)延后。②發(fā)生轉(zhuǎn)移的時(shí)間較晚、部位較單一，接種25天后才發(fā)現(xiàn)肺部有小的轉(zhuǎn)移灶，至自然死亡時(shí)僅發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移;其他部位接種的腫瘤均較早發(fā)生肺、肝、縱膈淋巴結(jié)和大網(wǎng)膜等部位的轉(zhuǎn)移。因此，該模型是一種較為理想的用于腫瘤局部治療療效評(píng)價(jià)及局部治療對(duì)肺轉(zhuǎn)移影響的動(dòng)物模型。
　　 腫瘤體積＞2mm3或腫瘤細(xì)胞個(gè)數(shù)＞107個(gè)時(shí)，腫瘤繼續(xù)增殖所需的充足氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)就需要由生

9、成新生血管來(lái)提供。腫瘤體積增長(zhǎng)超過(guò)1～2mm3，若無(wú)新生血管伸入，腫瘤組織將會(huì)持續(xù)休眠或者發(fā)生退化。一旦新生血管伸入腫瘤內(nèi)，供給充足的血液，腫瘤組織將快速生長(zhǎng)并且難以制止。
　　 多柔比星(Dox)為蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，抗瘤譜廣，廣泛應(yīng)用于實(shí)體瘤和血液惡性腫瘤的治療，對(duì)乏氧細(xì)胞有效;臨床上一般使用其鹽酸鹽，為橘紅色結(jié)晶，易溶于水;Dox口服吸收不良，臨床上一般靜脈注射給藥或者動(dòng)脈給藥;藥物通過(guò)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞;阻止DNA的復(fù)制，也

10、影響RNA的轉(zhuǎn)錄。研究顯示Dox在整個(gè)細(xì)胞周期均有活性作用，包括細(xì)胞間期。Dox獨(dú)具熒光特性，易于檢測(cè)其在細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度。
　　 本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究在于觀察實(shí)時(shí)三維超聲激勵(lì)微泡能否增強(qiáng)移植瘤化療，造影劑微泡采用瘤內(nèi)注射途徑給予。實(shí)時(shí)三維超聲，一方面可以顯示較深部位腫瘤，另一方面可以對(duì)腫瘤進(jìn)行輻照。本實(shí)驗(yàn)中建立的VX2移植瘤模型，發(fā)生轉(zhuǎn)移的時(shí)間較晚、部位單一，接種25天后才發(fā)現(xiàn)肺部有較小的轉(zhuǎn)移灶，至自然死亡時(shí)僅僅發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。對(duì)肌層內(nèi)的

11、腫瘤進(jìn)行實(shí)時(shí)三維超聲輻照聯(lián)合瘤內(nèi)注射微泡，以期為深部位腫瘤行實(shí)時(shí)三維超聲激勵(lì)瘤內(nèi)注射微泡增強(qiáng)化療的實(shí)驗(yàn)研究提供基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 探討實(shí)時(shí)三維超聲輻照瘤內(nèi)注射造影劑微泡增強(qiáng)VX2移植瘤化療效果的可行性。
　　 材料和方法：
　　 1.主要實(shí)驗(yàn)材料
　　 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑:①超聲輻照儀采用具有診斷作用的ViVi E9(GE公司制造)3V-D探頭，頻率1.5～4.0MHz。超聲診斷儀采用Phil

12、ips iU22彩色多普勒超聲儀，L9-3高頻線陣探頭，頻率4.0～9.0MHz，配有超聲造影模式。②造影劑微泡采用“全氟顯”（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院自制），其成膜材料為人血白蛋白，核心氣體為全氟丙烷。實(shí)驗(yàn)時(shí)以3ml生理鹽水溶解并緩慢搖勻，制成混懸液用做瘤體顯影及瘤內(nèi)注射，所產(chǎn)生微泡粒徑范圍2.5～4.0μm，濃度0.8～2.2×109個(gè)/ml;瘤內(nèi)注射微泡體積=1/2×瘤體體積。③注射用鹽酸多柔比星（Dox，深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司）10m

13、g/瓶，每瓶5ml生理鹽水稀釋，每只兔1.2ml/kg經(jīng)兔耳緣靜脈注射。
　　 其他試劑:速眠新Ⅱ注射液，阿托品，3％戊巴比妥鈉，肝素。
　　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:29只健康新西蘭大白兔，雌雄不限，體質(zhì)量2～2.5kg。另取2只健康新西蘭大白兔，供廇株傳代用。所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。2支凍存的VX2廇株由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
　　 2.VX2移植瘤模型
　　 2支凍存的VX2廇株常規(guī)復(fù)蘇

14、，分別制備成2.0ml組織懸液，分別取1ml接種至傳代兔右后肢外側(cè)肌層內(nèi)各1處。第14天，運(yùn)用0.35ml/kg速眠新Ⅱ注射液和0.25ml/kg阿托品注射液將傳代兔進(jìn)行肌肉注射麻醉，并建立耳緣靜脈通道以注射適量3％戊巴比妥鈉，側(cè)臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，荷瘤部位及其周圍1.5cm處脫毛，充分暴露，碘伏及酒精先后分別消毒兩次，無(wú)菌條件下取出瘤體，并迅速剔除周邊結(jié)締組織及中央壞死區(qū)，將剩余的新鮮魚肉樣組織置于無(wú)菌生理鹽水中，眼科剪將其剪成1mm

15、3的瘤粒，接種至29只健康新西蘭大白兔右后肢外側(cè)肌層內(nèi)，均1處。
　　 3.實(shí)驗(yàn)方法
　　 超聲診斷儀監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)情況:第11天，24只新西蘭大白兔存活，且瘤體造影劑微泡充盈，大小0.2～0.9cm3，全部用于實(shí)驗(yàn)。具體步驟如下:①隨機(jī)分為4組。A組:空白對(duì)照(Control)，不給予任何治療;B組:單純靜脈注射注射多柔比星(Dox);C組:實(shí)時(shí)三維超聲輻照瘤內(nèi)注射造影劑微泡(3-D+Bubble);D組:實(shí)時(shí)三維超聲輻

16、照瘤內(nèi)注射造影劑微泡及靜脈注射多柔比星（3-D+Bubble+Dox）。②超聲診斷儀定位腫瘤。③超聲輻照儀輸出強(qiáng)度的機(jī)械指數(shù)(MI)1.3，頻率1.5～4.0MHz，輻照時(shí)間為20min;超聲診斷儀引導(dǎo)下瘤內(nèi)注射微泡;經(jīng)兔耳緣靜脈緩慢注射多柔比星;3V-D探頭立即輻照瘤兔;第1、3、5、8天對(duì)腫瘤進(jìn)行治療。④第10天取材，HE染色觀察腫瘤病理組織學(xué);每次治療前及第10天取材前測(cè)量瘤體大小:超聲診斷儀探測(cè)腫瘤最大縱切面，測(cè)量腫瘤最大上下徑

17、(a)、前后徑(b)，在與最大縱切面垂直的切面上測(cè)量瘤體最大左右徑(c)，并計(jì)算腫瘤體積、瘤體相對(duì)生長(zhǎng)率及總體生長(zhǎng)率;4組分別依次進(jìn)行。
　　 4.腫瘤體積、瘤體相對(duì)生長(zhǎng)率及總體生長(zhǎng)率
　　 腫瘤體積(V)=∏/6×a×b×c(cm3)
　　 瘤體相對(duì)生長(zhǎng)率=（Vn-V1）/（Vn'-V1'）×100％，(Vn，V1)、(Vn'，V1')分別是處理組和對(duì)照組第n天及第1天治療前的體積
　　 瘤體總體生長(zhǎng)率

18、=（V10-V1）/（V10'-V1'）×100％
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，腫瘤體積用(x)±s表示。單因素方差分析比較同一時(shí)間組間瘤體相對(duì)生長(zhǎng)率及總體生長(zhǎng)率。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 ①HE病理組織學(xué):D組以凝固性壞死為主，C組廣泛的細(xì)胞固縮，B組壞死細(xì)胞分布于排列紊亂無(wú)極性的腫瘤細(xì)胞之中，A組浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞中見不