RUNX3抑制胃癌轉(zhuǎn)移的作用及分子機制研究.pdf

1、胃癌目前仍是我國死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤之一，五年生存率僅約20％。 轉(zhuǎn)移是腫瘤最具破壞性的本質(zhì)，也是胃癌患者死亡的主要原因。深刻理解胃癌轉(zhuǎn)移的分子機制對治療十分重要。Runt 結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子（RUNX1、RUNX2和RUNX3）是一組同源性較高的轉(zhuǎn)錄因子，它們與核心結(jié)合因子β亞基結(jié)合形成異源二聚體，作用于基因的啟動子、增強子或沉默子區(qū)域，調(diào)節(jié)基因的表達。RUNX-CBFbeta 復(fù)合體對基因的調(diào)節(jié)具有組織和階段特異性，RUNX蛋

2、白在個體發(fā)育中具有重要的作用；在受調(diào)節(jié)的靶基因中包括許多在腫瘤中發(fā)生變化的、與細胞命運相關(guān)的基因。 RUNX3 是Runt 結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族成員，最近被確定為抑癌基因，在肝癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌中都發(fā)現(xiàn)有不同比例的RUNX3 表達缺失。 研究發(fā)現(xiàn)在60％～90％的胃癌病例中存在RUNX3 的缺失，與胃癌患者的預(yù)后情況呈負相關(guān)。隨著胃癌分期的進展，缺失比例增高。RUNX3 敲除小鼠的胃粘膜上皮細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，激

3、活胃癌細胞的RUNX3 表達可以顯著抑制胃癌細胞的生長和成瘤性。因此RUNX3 表達下降或缺失在胃癌的發(fā)生和進展中具有重要作用。文獻表明，隨著胃癌分期進展RUNX3 缺失的比例增加。 在胃癌肝轉(zhuǎn)移細胞中RUNX3 的兩等位基因全部缺失，這些均提示RUNX3 在胃癌的轉(zhuǎn)移中可能具有重要作用，但RUNX3 的表達下降是否與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)還不明確。本課題將對此進行探討。 目的: 1、明確RUNX3 下降與胃癌侵襲、轉(zhuǎn)

4、移是否相關(guān)；2、探討RUNX3 抑制胃癌轉(zhuǎn)移的可能分子機制；3、篩選RUNX3 調(diào)控的下游基因。 方法: 1、利用免疫組化觀察RUNX3 在轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的表達；2、基因重組的方法構(gòu)建含有RUNX3 特異性SiRNA 的表達載體；3、用構(gòu)建的特異性SiRNA 的表達載體和RUNX3 的真核表達載體（Paul J Farrell 教授贈予）轉(zhuǎn)染胃癌細胞MKN28 和SGC7901，經(jīng)G418 篩選獲得穩(wěn)定表達的

5、細胞系。3、利用失巢培養(yǎng)模型、損傷刮擦實驗、體外侵襲實驗、裸鼠成瘤及Ⅷ因子染色、裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移實驗研究RUNX3 對胃癌細胞MKN28 和SGC7901 侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響；4、凝膠酶譜法檢測轉(zhuǎn)染胃癌細胞上清中分泌MMP2，MMP9 的活性變化；5、RT-PCR 及Western blot 檢測MMP2，MMP9，TIMP-1在mRNA 和蛋白水平的表達變化；ELISA 檢測TIMP-1、VEGF 在轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)上清中的水平。6、基因芯片

6、技術(shù)篩選RUNX3 相關(guān)的差異表達基因，并用RT-PCR 進行個別驗證。7、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測RUNX3 對TIMP-1 啟動子活性的調(diào)控作用。通過染色質(zhì)免疫共沉淀實驗（ChIP）和電泳遷移率實驗（EMSA）驗證細胞內(nèi)RUNX3 與TIMP-1 啟動子是否相互作用。 結(jié)果: 1、RUNX3 在轉(zhuǎn)移的胃癌組織中表達下降，RUNX3 可抑制胃癌細胞的轉(zhuǎn)移能力 利用免疫組化技術(shù)檢測了83 例無轉(zhuǎn)移胃癌和40

7、例有轉(zhuǎn)移胃癌中RUNX3的表達，發(fā)現(xiàn)RUNX3 在無轉(zhuǎn)移的胃癌中表達的陽性率（62.7％ (52/83)）高于有轉(zhuǎn)移的胃癌（42.5％ (17/40)），免疫組化評分結(jié)果顯示，RUNX3 在無轉(zhuǎn)移的胃癌中表達高于有轉(zhuǎn)移的胃癌(1.25±0.48 versus 0.57±0.26, P<0.05)，說明RUNX3 更多地表達在無轉(zhuǎn)移的胃癌組織。成功構(gòu)建了含有RUNX3 特異性SiRNA 的表達質(zhì)粒pSilencer-RUNX3。選取胃癌細

8、胞SGC7901（表達中等強度RUNX3）和MKN28（無RUNX3 的表達），pBK-RUNX3 轉(zhuǎn)染細胞后能上調(diào)RUNX3 的表達，pSilencer- RUNX3轉(zhuǎn)染細胞后能顯著抑制RUNX3 的表達。pBK-RUNX3 轉(zhuǎn)染細胞后，MKN28和SGC7901穿過Transewell 小室微孔膜的侵襲能力下降，抑制率分別為40.3％和42.5％，而pSilencer-RUNX3 轉(zhuǎn)染細胞后，SGC7901 細胞穿過Transewe

9、ll小室微孔膜的侵襲能力顯著增加。損傷刮擦實驗表明，RUNX3 可明顯抑制胃癌細胞的遷移運動能力。MTT 實驗表明，RUNX3 抑制細胞的失巢存活能力，轉(zhuǎn)染pBK-RUNX3 的SGC7901 細胞和MKN28 細胞在失巢培養(yǎng)24 小時后，其細胞生存率均明顯低于空載體對照組（ SGC7901:32.2％ vs 55.7％,MKN28:58.8％ vs 80.7％ P<0.05），而轉(zhuǎn)染pSilencer-RUNX3 的SGC7901 細

10、胞組的細胞生存率均高于空載體對照組（75.3％ vs 53.6％ P<0.05）。裸鼠成瘤后瘤體固定切片，Ⅷ因子染色表明轉(zhuǎn)染pBK-RUNX3 瘤體中微血管密度（MDV）顯著下降（P<0.05），而pSilencer- RUNX3 轉(zhuǎn)染細胞后瘤體中MDV增多（P<0.05），說明RUNX3 可抑制胃癌新生血管生成。裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pBK-RUNX3 后細胞在裸鼠肺部及肝部形成的可見轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)明顯少于對照（SGC7901 和MK

11、N28 中均為P<0.05）而轉(zhuǎn)染pSilencer-RUNX3后形成的可見轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)明顯多于對照組(P<0.05)。 2、RUNX3 可以通過調(diào)節(jié)TIMP-1、VEGF、CRKⅡ等分子的表達抑制胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力 我們通過凝膠酶譜試驗發(fā)現(xiàn)RUNX3 可抑制胃癌細胞中MMP9 的活性(SGC7901 和MKN28 中均為P<0.05)，RUNX3 特異性siRNA 則增強SGC7901細胞MMP9 的活性(P<0.0

12、5)；而對MMP2 的活性無顯著影響。RT-PCR 和Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)MMP2 和MMP9 的表達水平并無明顯變化。因此，RUNX3 對MMP9 的調(diào)節(jié)可能不在mRNA 和蛋白水平，而可能通過其它分子影響MMP9 的活性。TIMP-1 是MMP9 主要的內(nèi)源抑制因子，進一步RT-PCR、Western blot 及ELISA 的結(jié)果證實，RUNX3 能上調(diào)TIMP-1 在mRNA 和蛋白水平的表達以及胃癌細胞培養(yǎng)上清中

13、TIMP-1 的水平，因此RUNX3 可通過上調(diào)TIMP-1 的表達水平，從而抑制MMP9 的酶活性；ELISA 還發(fā)現(xiàn)RUNX3可以抑制胃癌細胞培養(yǎng)上清中VEGF 的表達水平，提示RUNX3 通過抑制VEGF 的表達而減少胃癌的血管生成。經(jīng)過Trizol 法抽提SGC7901/ pBK-RUNX3 和空載體轉(zhuǎn)染的對照細胞SGC7901/ pBK-CMV 兩種細胞的總RNA，通過瓊脂糖電泳檢查及紫外定量分析表明所提取得RNA 無明顯降解

14、，其質(zhì)和量均符合芯片檢測要求。經(jīng)熒光探針的制備、純化及定量，芯片雜交、圖像采集和數(shù)據(jù)分析等步驟得到差異表達的基因。我們以兩種細胞信號強度的比值小于0.5 或者大于2 作為判定標準，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照細胞相比，RUNX3 表達上調(diào)后，SGC7901/pBK-RUNX3 細胞中有14 個基因表達被上調(diào)，109 個基因表達被下調(diào)。在基因芯片篩選出的下游基因中，我們通過RT-PCR 對個別差異表達得基因進行驗證，證實接頭分子CRKⅡ的表達在胃癌細

15、胞MKN28 和SGC7901中可被RUNX3 抑制。 3、RUNX3 作為轉(zhuǎn)錄因子增強TIMP-1 在轉(zhuǎn)錄水平的表達雙熒光素酶報告 基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示， pBK-RUNX3 質(zhì)粒與pGL-TIMP-1共轉(zhuǎn)染MKN28 細胞后，細胞內(nèi)的激發(fā)熒光強度顯著高于質(zhì)粒與pBK-CMV空載體轉(zhuǎn)染的MKN28 細胞。表明RUNX3 可以增強TIMP-1 啟動子的活性ChIP 實驗發(fā)現(xiàn)，設(shè)計擴增包含TIMP-1 啟動子上2 個RUNX

16、3 結(jié)合位點的序列的特異性引物，經(jīng)RUNX3 抗體沉淀后的DNA 模版可以擴增出特異性的片段，提示無論是內(nèi)源性表達的RUNX3 還是外源性的RUNX3 均可在細胞內(nèi)與TIMP-1 的啟動子結(jié)合并相互作用。進一步EMSA 和Supper Shift 試驗結(jié)果顯示：SGC7901 細胞核蛋白提取物可以使TIMP-1 啟動子的雙鏈DNA 探針的電泳條帶滯后，而RUNX3 抗體可以使電泳條帶進一步滯后。表明RUNX3 可以與TIMP-1 啟動子

17、上的兩個保守結(jié)合位點結(jié)合。 結(jié)論: 本研究提供了抑癌基因RUNX3 具有抑制胃癌轉(zhuǎn)移作用的證據(jù)，同時，我們發(fā)現(xiàn)這種作用可能與以下機制有關(guān)：RUNX3 作為轉(zhuǎn)錄因子，增強下游靶基因TIMP-1 的轉(zhuǎn)錄及表達，抑制MMP9 的活性，從而抑制胃癌細胞侵襲能力；RUNX3 抑制下游基因CRKⅡ的表達，從而抑制胃癌細胞的運動遷移能力及失巢存活能力；RUNX3 抑制下游基因VEGF 的表達，從而抑制胃癌血管生成。這些發(fā)現(xiàn)有助于RU