RUNX3抑制胃癌轉(zhuǎn)移的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、胃癌目前仍是我國(guó)死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤之一，五年生存率僅約20％。 轉(zhuǎn)移是腫瘤最具破壞性的本質(zhì)，也是胃癌患者死亡的主要原因。深刻理解胃癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)治療十分重要。Runt 結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子（RUNX1、RUNX2和RUNX3）是一組同源性較高的轉(zhuǎn)錄因子，它們與核心結(jié)合因子β亞基結(jié)合形成異源二聚體，作用于基因的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或沉默子區(qū)域，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。RUNX-CBFbeta 復(fù)合體對(duì)基因的調(diào)節(jié)具有組織和階段特異性，RUNX蛋

2、白在個(gè)體發(fā)育中具有重要的作用；在受調(diào)節(jié)的靶基因中包括許多在腫瘤中發(fā)生變化的、與細(xì)胞命運(yùn)相關(guān)的基因。 RUNX3 是Runt 結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族成員，最近被確定為抑癌基因，在肝癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌中都發(fā)現(xiàn)有不同比例的RUNX3 表達(dá)缺失。 研究發(fā)現(xiàn)在60％～90％的胃癌病例中存在RUNX3 的缺失，與胃癌患者的預(yù)后情況呈負(fù)相關(guān)。隨著胃癌分期的進(jìn)展，缺失比例增高。RUNX3 敲除小鼠的胃粘膜上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，激

3、活胃癌細(xì)胞的RUNX3 表達(dá)可以顯著抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和成瘤性。因此RUNX3 表達(dá)下降或缺失在胃癌的發(fā)生和進(jìn)展中具有重要作用。文獻(xiàn)表明，隨著胃癌分期進(jìn)展RUNX3 缺失的比例增加。 在胃癌肝轉(zhuǎn)移細(xì)胞中RUNX3 的兩等位基因全部缺失，這些均提示RUNX3 在胃癌的轉(zhuǎn)移中可能具有重要作用，但RUNX3 的表達(dá)下降是否與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)還不明確。本課題將對(duì)此進(jìn)行探討。 目的: 1、明確RUNX3 下降與胃癌侵襲、轉(zhuǎn)

4、移是否相關(guān)；2、探討RUNX3 抑制胃癌轉(zhuǎn)移的可能分子機(jī)制；3、篩選RUNX3 調(diào)控的下游基因。 方法: 1、利用免疫組化觀察RUNX3 在轉(zhuǎn)移和無(wú)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的表達(dá)；2、基因重組的方法構(gòu)建含有RUNX3 特異性SiRNA 的表達(dá)載體；3、用構(gòu)建的特異性SiRNA 的表達(dá)載體和RUNX3 的真核表達(dá)載體（Paul J Farrell 教授贈(zèng)予）轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞MKN28 和SGC7901，經(jīng)G418 篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的

5、細(xì)胞系。3、利用失巢培養(yǎng)模型、損傷刮擦實(shí)驗(yàn)、體外侵襲實(shí)驗(yàn)、裸鼠成瘤及Ⅷ因子染色、裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)研究RUNX3 對(duì)胃癌細(xì)胞MKN28 和SGC7901 侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響；4、凝膠酶譜法檢測(cè)轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞上清中分泌MMP2，MMP9 的活性變化；5、RT-PCR 及Western blot 檢測(cè)MMP2，MMP9，TIMP-1在mRNA 和蛋白水平的表達(dá)變化；ELISA 檢測(cè)TIMP-1、VEGF 在轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中的水平。6、基因芯片

6、技術(shù)篩選RUNX3 相關(guān)的差異表達(dá)基因，并用RT-PCR 進(jìn)行個(gè)別驗(yàn)證。7、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)RUNX3 對(duì)TIMP-1 啟動(dòng)子活性的調(diào)控作用。通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)（ChIP）和電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA）驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi)RUNX3 與TIMP-1 啟動(dòng)子是否相互作用。 結(jié)果: 1、RUNX3 在轉(zhuǎn)移的胃癌組織中表達(dá)下降，RUNX3 可抑制胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力 利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)了83 例無(wú)轉(zhuǎn)移胃癌和40

7、例有轉(zhuǎn)移胃癌中RUNX3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RUNX3 在無(wú)轉(zhuǎn)移的胃癌中表達(dá)的陽(yáng)性率（62.7％ (52/83)）高于有轉(zhuǎn)移的胃癌（42.5％ (17/40)），免疫組化評(píng)分結(jié)果顯示，RUNX3 在無(wú)轉(zhuǎn)移的胃癌中表達(dá)高于有轉(zhuǎn)移的胃癌(1.25±0.48 versus 0.57±0.26, P<0.05)，說(shuō)明RUNX3 更多地表達(dá)在無(wú)轉(zhuǎn)移的胃癌組織。成功構(gòu)建了含有RUNX3 特異性SiRNA 的表達(dá)質(zhì)粒pSilencer-RUNX3。選取胃癌細(xì)

8、胞SGC7901（表達(dá)中等強(qiáng)度RUNX3）和MKN28（無(wú)RUNX3 的表達(dá)），pBK-RUNX3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能上調(diào)RUNX3 的表達(dá)，pSilencer- RUNX3轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能顯著抑制RUNX3 的表達(dá)。pBK-RUNX3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，MKN28和SGC7901穿過(guò)Transewell 小室微孔膜的侵襲能力下降，抑制率分別為40.3％和42.5％，而pSilencer-RUNX3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，SGC7901 細(xì)胞穿過(guò)Transewe

9、ll小室微孔膜的侵襲能力顯著增加。損傷刮擦實(shí)驗(yàn)表明，RUNX3 可明顯抑制胃癌細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力。MTT 實(shí)驗(yàn)表明，RUNX3 抑制細(xì)胞的失巢存活能力，轉(zhuǎn)染pBK-RUNX3 的SGC7901 細(xì)胞和MKN28 細(xì)胞在失巢培養(yǎng)24 小時(shí)后，其細(xì)胞生存率均明顯低于空載體對(duì)照組（ SGC7901:32.2％ vs 55.7％,MKN28:58.8％ vs 80.7％ P<0.05），而轉(zhuǎn)染pSilencer-RUNX3 的SGC7901 細(xì)

10、胞組的細(xì)胞生存率均高于空載體對(duì)照組（75.3％ vs 53.6％ P<0.05）。裸鼠成瘤后瘤體固定切片，Ⅷ因子染色表明轉(zhuǎn)染pBK-RUNX3 瘤體中微血管密度（MDV）顯著下降（P<0.05），而pSilencer- RUNX3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后瘤體中MDV增多（P<0.05），說(shuō)明RUNX3 可抑制胃癌新生血管生成。裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pBK-RUNX3 后細(xì)胞在裸鼠肺部及肝部形成的可見(jiàn)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)明顯少于對(duì)照（SGC7901 和MK

11、N28 中均為P<0.05）而轉(zhuǎn)染pSilencer-RUNX3后形成的可見(jiàn)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)明顯多于對(duì)照組(P<0.05)。 2、RUNX3 可以通過(guò)調(diào)節(jié)TIMP-1、VEGF、CRKⅡ等分子的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力 我們通過(guò)凝膠酶譜試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RUNX3 可抑制胃癌細(xì)胞中MMP9 的活性(SGC7901 和MKN28 中均為P<0.05)，RUNX3 特異性siRNA 則增強(qiáng)SGC7901細(xì)胞MMP9 的活性(P<0.0

12、5)；而對(duì)MMP2 的活性無(wú)顯著影響。RT-PCR 和Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MMP2 和MMP9 的表達(dá)水平并無(wú)明顯變化。因此，RUNX3 對(duì)MMP9 的調(diào)節(jié)可能不在mRNA 和蛋白水平，而可能通過(guò)其它分子影響MMP9 的活性。TIMP-1 是MMP9 主要的內(nèi)源抑制因子，進(jìn)一步RT-PCR、Western blot 及ELISA 的結(jié)果證實(shí)，RUNX3 能上調(diào)TIMP-1 在mRNA 和蛋白水平的表達(dá)以及胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中

13、TIMP-1 的水平，因此RUNX3 可通過(guò)上調(diào)TIMP-1 的表達(dá)水平，從而抑制MMP9 的酶活性；ELISA 還發(fā)現(xiàn)RUNX3可以抑制胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF 的表達(dá)水平，提示RUNX3 通過(guò)抑制VEGF 的表達(dá)而減少胃癌的血管生成。經(jīng)過(guò)Trizol 法抽提SGC7901/ pBK-RUNX3 和空載體轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞SGC7901/ pBK-CMV 兩種細(xì)胞的總RNA，通過(guò)瓊脂糖電泳檢查及紫外定量分析表明所提取得RNA 無(wú)明顯降解

14、，其質(zhì)和量均符合芯片檢測(cè)要求。經(jīng)熒光探針的制備、純化及定量，芯片雜交、圖像采集和數(shù)據(jù)分析等步驟得到差異表達(dá)的基因。我們以兩種細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度的比值小于0.5 或者大于2 作為判定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照細(xì)胞相比，RUNX3 表達(dá)上調(diào)后，SGC7901/pBK-RUNX3 細(xì)胞中有14 個(gè)基因表達(dá)被上調(diào)，109 個(gè)基因表達(dá)被下調(diào)。在基因芯片篩選出的下游基因中，我們通過(guò)RT-PCR 對(duì)個(gè)別差異表達(dá)得基因進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)接頭分子CRKⅡ的表達(dá)在胃癌細(xì)

15、胞MKN28 和SGC7901中可被RUNX3 抑制。 3、RUNX3 作為轉(zhuǎn)錄因子增強(qiáng)TIMP-1 在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)雙熒光素酶報(bào)告 基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示， pBK-RUNX3 質(zhì)粒與pGL-TIMP-1共轉(zhuǎn)染MKN28 細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的激發(fā)熒光強(qiáng)度顯著高于質(zhì)粒與pBK-CMV空載體轉(zhuǎn)染的MKN28 細(xì)胞。表明RUNX3 可以增強(qiáng)TIMP-1 啟動(dòng)子的活性ChIP 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增包含TIMP-1 啟動(dòng)子上2 個(gè)RUNX

16、3 結(jié)合位點(diǎn)的序列的特異性引物，經(jīng)RUNX3 抗體沉淀后的DNA 模版可以擴(kuò)增出特異性的片段，提示無(wú)論是內(nèi)源性表達(dá)的RUNX3 還是外源性的RUNX3 均可在細(xì)胞內(nèi)與TIMP-1 的啟動(dòng)子結(jié)合并相互作用。進(jìn)一步EMSA 和Supper Shift 試驗(yàn)結(jié)果顯示：SGC7901 細(xì)胞核蛋白提取物可以使TIMP-1 啟動(dòng)子的雙鏈DNA 探針的電泳條帶滯后，而RUNX3 抗體可以使電泳條帶進(jìn)一步滯后。表明RUNX3 可以與TIMP-1 啟動(dòng)子

17、上的兩個(gè)保守結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。 結(jié)論: 本研究提供了抑癌基因RUNX3 具有抑制胃癌轉(zhuǎn)移作用的證據(jù)，同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)這種作用可能與以下機(jī)制有關(guān)：RUNX3 作為轉(zhuǎn)錄因子，增強(qiáng)下游靶基因TIMP-1 的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，抑制MMP9 的活性，從而抑制胃癌細(xì)胞侵襲能力；RUNX3 抑制下游基因CRKⅡ的表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移能力及失巢存活能力；RUNX3 抑制下游基因VEGF 的表達(dá)，從而抑制胃癌血管生成。這些發(fā)現(xiàn)有助于RU