轉(zhuǎn)錄因子RUNX2在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其分子機(jī)制探究.pdf

1、盡管近年來(lái)發(fā)病率有所降低，在全球范圍內(nèi)，胃癌依舊是致死率全球第五的高度惡性的腫瘤。盡管消化道內(nèi)鏡檢查已引入到胃癌早期臨床診斷過(guò)程中，仍有65％的患者首診就發(fā)現(xiàn)有胃癌的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且進(jìn)展期胃癌患者的5年生存率低至5％-15％。
　　侵襲與轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)和多藥耐藥均被認(rèn)為是胃癌患者預(yù)后不良，術(shù)后生存時(shí)間短的重要原因。胃癌，這一消化道惡性腫瘤的諸多惡性生物學(xué)行為其背后的分子機(jī)制至今仍不清楚。而報(bào)道已證實(shí)，轉(zhuǎn)錄因子RUNX2參與促進(jìn)多

2、種易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移行為的發(fā)生，同時(shí)，我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RUNX2在胃癌干細(xì)胞中高表達(dá)，因此，我們的研究旨在揭示RUNX2在促進(jìn)胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為及其分子機(jī)制。經(jīng)大樣本臨床免疫組化檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，RUNX2是胃癌患者預(yù)后的一個(gè)極為重要的提示因子。與此同時(shí)，一系列的體外實(shí)驗(yàn)和原位移植瘤動(dòng)物模型的數(shù)據(jù)證實(shí)，RUNX2是維持胃癌細(xì)胞移植瘤成瘤及侵襲轉(zhuǎn)移等惡性行為的重要因子。因此，為了明確此作用內(nèi)在的分子機(jī)制，我們進(jìn)行了染色質(zhì)免疫共沉淀

3、和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)，轉(zhuǎn)錄因子RUNX2的轉(zhuǎn)錄激活位點(diǎn)落在CXCR4的啟動(dòng)子區(qū)上。CXCR4是RUNX2下游極為重要的靶基因，在胃癌中，RUNX2主要通過(guò)激活CXCR4的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的作用。接著，我們通過(guò)采用慢病毒干擾下調(diào)CXCR4或添加AMD3100處理的方法，在RUNX2高表達(dá)的情況下抑制CXCR4信號(hào)通路的活化。由此，我們通過(guò)體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抑制CXCR4信號(hào)通路的活性可逆轉(zhuǎn)由RUNX2所介導(dǎo)

4、促侵襲轉(zhuǎn)移的作用。因此，RUNX2可作為一個(gè)有價(jià)值的臨床腫瘤診療因子，可預(yù)示患者的預(yù)后，同時(shí)RUNX2/CXCR4通路的揭示為我們提供了第一手實(shí)驗(yàn)室證據(jù)，是今后針對(duì)該通路進(jìn)行的靶向藥物研發(fā)的重要依據(jù)。
　　主要方法，研究結(jié)果和結(jié)論如下:
　　1.RUNX2在胃癌干細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中的表達(dá)。(1)通過(guò)比較成球狀態(tài)胃癌細(xì)胞和單層培養(yǎng)的胃痛細(xì)胞的DNA表達(dá)譜芯片結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，RUNX2在成球狀態(tài)胃癌細(xì)胞中顯著高表達(dá)50余倍。通過(guò)無(wú)血清

5、成球培養(yǎng)法，常被認(rèn)為是富集胃癌干細(xì)胞(GCSCs)的主要方法。(2)基于以上基因芯片結(jié)果，我們采用GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)方法進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)，以RUNX2為核心的一群基因簇群（共同代表著一類生物學(xué)功能）在胃癌干細(xì)胞中為顯著活化的狀態(tài)，在GSEA中獲高的富集得分。(3)通過(guò)免疫熒光染色觀察后發(fā)現(xiàn)， RUNX2在成球培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞中高表達(dá)。(4)與此同時(shí)，RUNX2在SGC7901，MG

6、C803和XN0422中均被檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，RUNX2在SGC7901細(xì)胞中低表達(dá)，在MGC803和XN0422細(xì)胞中顯著高表達(dá)。
　　2.胃癌中，RUNX2的表達(dá)與胃痛臨床病理參數(shù)和患者的預(yù)后密切相關(guān)。(1)共305例有完全隨訪信息的胃癌病理標(biāo)本的免疫組化發(fā)現(xiàn)，RUNX2與臨床病理參數(shù)，如TNM分級(jí)、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移和侵潤(rùn)深度正相關(guān)。RUNX2主要定位在胃癌細(xì)胞核內(nèi)，僅少部分表達(dá)呈現(xiàn)胞核胞漿同時(shí)表達(dá)，且在不同分化程度的胃癌中，其表

7、達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)。在81例高/中分化胃痛中，有49例(60.5％)的患者高表達(dá)RUNX2，這一比例在低分化胃癌病例中，RUNX2高表達(dá)比例占總?cè)后w的76.3％(171/224)。同時(shí)，RUNX2的高低表達(dá)與胃癌患者的TNM分期正相關(guān)(P=0.000)。在TNMⅠ期和Ⅱ期的共124位胃癌患者中，有49位患者被檢測(cè)出具有RUNX2的低表達(dá)(49/124，39.5％)，75例患者則為RUNX2的高表達(dá)(75/124，60.5

8、％)。然而，在181例TNMⅢ期和Ⅳ期的胃癌患者人群中，有145例患者表現(xiàn)出RUNX2高表達(dá)(145/181，80.1％)。此外，RUNX2的高表達(dá)還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.000)和深部浸潤(rùn)(P=0.000)相關(guān)。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者中，大約79.3％的患者被檢出RUNX2高表達(dá)(161/203)。而在發(fā)現(xiàn)漿膜浸潤(rùn)的胃癌患者中，超過(guò)79.1％的患者有RUNX2的高表達(dá)(178/225)。最后，RUNX2的表達(dá)與患者的年齡(P=0.3

9、52)和性別(P=0.480)無(wú)關(guān)。(2)比較胃癌癌組織和癌旁組織RUNX2的表達(dá)也發(fā)現(xiàn)，在癌組織中，RUNX2高表達(dá)的比例為72.1％(220/305)，而癌旁組織該比例僅為21.6％(66/305)(P=0.00);(3)在305例胃癌病例中，有220例呈RUNX2高表達(dá)狀態(tài)。高表達(dá)的胃癌患者群體總體預(yù)后不良，術(shù)后生存時(shí)間短。RUNX2低表達(dá)的患者預(yù)后好，有較長(zhǎng)的術(shù)后生存期。以上研究證實(shí)，RUNX2表達(dá)水平提示胃癌患者的總體預(yù)后;(

10、4)通過(guò)多因素分析的方法發(fā)現(xiàn)，RUNX2表達(dá)(HR3.454，95％CI1.408-8.230，P=0.007)，與淋巴轉(zhuǎn)移(HR1.539，95％CI1.089-2.591，P=0.045)和侵潤(rùn)深度(HR1.620，95％CI1.022-2.567，P=0.040)共同預(yù)示患者的預(yù)后情況，數(shù)據(jù)顯示TNM分期(HR1.293，95％CI0.846-1.975，P=0.235)和分化程度(HR0.704，95％CI0.488-1.016

11、，P=0.061)這一指標(biāo)似無(wú)作用，分析原因可能為采集的樣本例數(shù)較少。.
　　3.RUNX2促進(jìn)胃痛細(xì)胞移植瘤成瘤及體內(nèi)外侵襲轉(zhuǎn)移。(1)RUNX2參與胃痛移植瘤成瘤能力維持。通過(guò)將胃癌細(xì)胞系移植于裸鼠皮下，進(jìn)行移植瘤成瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在穩(wěn)定上調(diào)RUNX2表達(dá)的胃癌細(xì)胞株SGC7901-exRUNX2中，其皮下移植瘤成瘤能力顯著增強(qiáng)。移植瘤重量與大小的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果也證實(shí)了以上結(jié)論。(2)RUNX2促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。體外細(xì)胞劃痕實(shí)

12、驗(yàn)用于評(píng)估胃癌細(xì)胞的平面遷移運(yùn)動(dòng)能力。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在SGC7901中穩(wěn)定上調(diào)RUNX2后，腫瘤細(xì)胞遷移的距離遠(yuǎn)大于對(duì)照組細(xì)胞(Control)。而在MGC803和原代細(xì)胞XN0422中穩(wěn)定敲低RUNX2的表達(dá)后，細(xì)胞遷移距離縮短，提示遷移能力受損。侵襲實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，RUNX2的表達(dá)與細(xì)胞體外侵襲能力正相關(guān)。同時(shí)，匯總綜合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)的方法，基于胃癌發(fā)生發(fā)展的規(guī)律，改良了胃癌原位移植瘤的裸鼠模型，并通過(guò)該動(dòng)物模型證實(shí)，RUNX2上調(diào)后，胃癌

13、細(xì)胞在胃部的局部侵襲能力顯著增強(qiáng)，可向鄰近肝臟轉(zhuǎn)移。穩(wěn)定敲低RUNX2后，胃癌細(xì)胞的局部侵襲與肝臟轉(zhuǎn)移能力顯著受損。因此，RUNX2在體內(nèi)外均促胃癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移。
　　4.轉(zhuǎn)錄因子RUNX2直接轉(zhuǎn)錄激活CXCR4基因。(1)通過(guò)采用轉(zhuǎn)錄因子生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)對(duì)與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因進(jìn)行評(píng)分后發(fā)現(xiàn)，CXCR4的得分最高(11.462)。通過(guò)real-time PCR在MGC803和原代細(xì)胞XN0422中對(duì)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因

14、進(jìn)行篩選后發(fā)現(xiàn)，CXCR4差異倍數(shù)最高，且是兩種細(xì)胞中均降低的分子。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因包括，MMP家族成員，趨化因子受體CXCR4以及EMT現(xiàn)象相關(guān)基因，其中，MMPs在諸多腫瘤，如骨肉瘤，乳腺癌和前列腺癌中被報(bào)道是RUNX2的下游靶基因。(2)通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在CXCR4啟動(dòng)子區(qū)上存在一段277堿基的片段，高度疑似RUNX2的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)。(3)基于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的結(jié)果所提示的15bp的片段，我們?cè)O(shè)計(jì)了突變型的熒光素酶

15、報(bào)告載體。熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)及后續(xù)的凝膠電泳遷移率試驗(yàn)證實(shí)，這15個(gè)堿基的片段，正是轉(zhuǎn)錄因子RUNX2在CXCR4基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的位點(diǎn)。(4)與此同時(shí)，我們還對(duì)之前Ch-IP試驗(yàn)所明確的277個(gè)堿基片段進(jìn)行50個(gè)堿基的遞增分段截短構(gòu)建相應(yīng)的熒光素酶報(bào)告載體，后續(xù)的熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)證實(shí)第一個(gè)被截短的50個(gè)堿基內(nèi)存在RUNX2的結(jié)合位點(diǎn)。而這一結(jié)論，與先前的試驗(yàn)結(jié)果相一致。(5)最后，WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CXCR4的表達(dá)與RUNX2水平的正相關(guān)關(guān)

16、系。
　　5.CXCR4是RUNX2調(diào)控胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要的下游因子。(1)在RUNX2上調(diào)的同時(shí)，我們通過(guò)穩(wěn)定敲低CXCR4或用CXCR4信號(hào)通路特異性抑制劑AMD3100的方法抑制CXCR4信號(hào)通路活化，趨化實(shí)驗(yàn)證實(shí)胃癌細(xì)胞趨化遷移能力顯著受損。(2)細(xì)胞侵襲試驗(yàn)證實(shí)，細(xì)胞侵襲能力受CXCR4信號(hào)通路抑制而受損。(3)抑制CXCR4信號(hào)通路后，在裸鼠胃癌原位移植瘤模型中的結(jié)果更具有說(shuō)服力，胃癌細(xì)胞的局部侵襲能力受顯著抑制，同時(shí)

17、肝臟轉(zhuǎn)移能力顯著受損。以上數(shù)據(jù)證實(shí)，CXCR4作為RUNX2下游一個(gè)極為重要的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮維持胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用。
　　總之，通過(guò)大樣本臨床組化檢測(cè)證實(shí)，RUNX2與多種臨床病理參數(shù)密切相關(guān)，是胃癌患者的重要的預(yù)示因子。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，RUNX2通過(guò)直接轉(zhuǎn)錄激活CXCR4進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生。通過(guò)抑制CXCR4信號(hào)通路活性可顯著降低胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，顯著延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間。以上結(jié)果表明，RUNX2可作為臨床腫瘤診療的