原發(fā)性股骨頭無菌性壞死蛋白質(zhì)組學(xué)的實驗研究.pdf

1、研究目的： 1．應(yīng)用蛋白雙向電泳技術(shù)，摸索人血漿蛋白雙向電泳分離技術(shù)和條件，建立和優(yōu)化人血漿蛋白標(biāo)準(zhǔn)電泳圖譜； 2．以標(biāo)準(zhǔn)人血漿蛋白雙向電泳條件及參數(shù)為依據(jù)，對正常人群及原發(fā)性股骨頭無菌性壞死患者的血漿蛋白電泳圖譜進行配對分析比較，尋找差異蛋白質(zhì)點；應(yīng)用質(zhì)譜鑒定技術(shù)，對差異蛋白質(zhì)點進行鑒定；應(yīng)用Western Blot技術(shù)對所鑒定的蛋白質(zhì)進行驗證；經(jīng)生物信息學(xué)檢索，分析所鑒定的蛋白質(zhì)在原發(fā)性股骨頭無菌性壞死病理機制中的作

2、用，從而確立原發(fā)性股骨頭無菌性壞死血漿疾病相關(guān)蛋白質(zhì)； 3．應(yīng)用受試者工作特征分析法，對所鑒定的蛋白質(zhì)在原發(fā)性股骨頭無菌性壞死血漿臨床診斷實驗中的作用進行初步評價，為其進一步臨床檢驗的應(yīng)用提供參考依據(jù)，同時為今后原發(fā)性股骨頭無菌性壞死的治療及各種治療手段的血漿學(xué)療效評估奠定基礎(chǔ)。 材料與方法： 采用Amersham Biosciences公司IPGphor IEF System進行等電聚焦、the EttanDA

3、LT Ⅱ system進行垂直電泳；Imagescanner LabScan software進行電泳圖像采集，ImageMaster 2D Elite進行圖像分析；應(yīng)用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)protein sequencer(MALDI-TOF MS)進行質(zhì)譜鑒定，Mascot軟件檢索SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫同時行蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析；在Western Blot過程中，應(yīng)用Bio-Rad濕式電轉(zhuǎn)儀進行轉(zhuǎn)膜，經(jīng)封閉、一抗孵育、

4、二抗孵育及蛋白檢測等過程，對所鑒定的蛋白質(zhì)進行驗證；應(yīng)用ELISA法對所鑒定的蛋白質(zhì)在原發(fā)性股骨頭無菌性壞死(idiopathic osteonecrosis of the femoral head ONFH)臨床血漿檢驗中的應(yīng)用進行受試者工作特征(Receiver Operating Characteristic ROC)分析。所有血漿標(biāo)本均在受檢者本人或其家屬的知情同意下獲取。 1、晨起空腹條件下采集健康志愿者靜脈血2ml，

5、離心后收集血漿，Bradford法測定蛋白濃度；按Amersham Bioscienses公司Albumin/IgG Remove kit試劑盒的操作說明去除血漿白蛋白和IgG；向上述已去除白蛋白和IgG的濾液中加入4倍體積的冰丙酮，-20℃孵育，2h以上(或過夜)；-4℃ 13000g離心10-20min；棄去丙酮，用干凈的濾紙吸去丙酮液滴，于超凈臺中風(fēng)干：在處理好的樣品中加入相應(yīng)IPG膠條所需的溶脹液，混勻至少30S，室溫孵育至全部

6、溶解；以12000g速度離心，5min，以除去雜質(zhì)和泡沫；根據(jù)所選用IPG膠條pH及長度的不同，選用不同的IPG泡脹槽(IPG Holder)；在泡脹槽陽極附近均勻加入不同濃度的上樣液；將IPG膠條置入膠條槽進行溶脹；結(jié)束溶脹后設(shè)置不同的IPGphor儀器運行參數(shù)進行等電聚焦；結(jié)束后從泡脹槽中取出膠條，進行兩次震蕩平衡各10min。預(yù)灌制好SDS-PAGE膠后，將平衡好的IPG膠條置于SDS膠面上，低熔點0.5﹪瓊脂糖封膠，設(shè)定電泳條件

7、進行垂直聚焦，直至溴酚藍達膠底線。電泳結(jié)束后，對凝膠進行考馬斯亮藍染色及硝酸銀染色；凝膠用圖像掃描儀掃描，分析上述不同的電泳條件對凝膠圖像的影響，從而選擇出最優(yōu)化的電泳條件，建立人血漿標(biāo)準(zhǔn)雙向電泳圖譜。 2、以上述標(biāo)準(zhǔn)人血漿蛋白雙向電泳條件及參數(shù)為依據(jù)，分別采集正常人群及ONFH患者的外周靜脈血，離心獲取血漿后分別于相同條件下行蛋白雙向電泳，標(biāo)準(zhǔn)化各自圖譜后進行配對分析比較，尋找差異蛋白質(zhì)點；應(yīng)用質(zhì)譜鑒定技術(shù)，獲取差異蛋白質(zhì)點的

8、肽譜圖等信息，Mascot軟件檢索SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫對差異蛋白質(zhì)點進行鑒定，應(yīng)用Western Blot法對所鑒定的蛋白質(zhì)進行驗證，從而確立ONFH血漿相關(guān)疾病蛋白。經(jīng)生物信息學(xué)分析，闡述上述所鑒定的疾病相關(guān)蛋白質(zhì)在ONFH疾病病理機制中的可能作用。 3、應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)對上述所鑒定的蛋白質(zhì)在ONFH診斷實驗中的作用進行ROC分析，初步評價各差異蛋白質(zhì)診斷的敏感性、特異性及符合率等指標(biāo)。 結(jié)果：

9、 1、經(jīng)過對血漿白蛋白和IgG的去除、IPG膠條的選擇、蛋白上樣量、等電聚焦參數(shù)、平衡條件、兩向之間的轉(zhuǎn)移、SDS-聚丙烯酰胺凝膠的濃度、垂直電泳以及凝膠染色等血漿蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳的關(guān)鍵步驟進行優(yōu)化，建立了可重復(fù)、穩(wěn)定性好以及蛋白質(zhì)分離效果好的血漿蛋白質(zhì)2-DE標(biāo)準(zhǔn)圖譜及其技術(shù)。 2、比較正常人群及ONFH患者的血漿2-DE圖譜，發(fā)現(xiàn)二者之間存在7個差異蛋白質(zhì)點，其中3個蛋白質(zhì)點在ONFH患者的血漿圖譜中顯著升高，而另

10、外4個差異蛋白質(zhì)點顯著降低。經(jīng)質(zhì)譜鑒定，升高的3個蛋白質(zhì)點分別為PAI-1、crosslaps以及anti-p53 antibody，降低的4個蛋白質(zhì)點有3個得到了鑒定，分別是t-PA， BGP和c-sis，而另一蛋白質(zhì)點未能確定，其分子量為9.82kDa，pI為5.64，可能是一新的蛋白質(zhì)。經(jīng)western Blot驗證，證實上述所鑒定的差異蛋白質(zhì)點的鑒定結(jié)果可信。 3、經(jīng)生物信息學(xué)檢索，發(fā)現(xiàn)所鑒定的6個差異蛋白質(zhì)與血液凝血異

11、常、原癌基因及抑癌基因調(diào)空失衡導(dǎo)致的細胞凋亡異常、成骨細胞活動下降導(dǎo)致的BGP合成和分泌減少以及骨基質(zhì)-Ⅰ型膠原代謝異常有關(guān)，提示這6種蛋白質(zhì)在ONFH的病理機制中起著非常重要的作用。另一未能鑒定的差異蛋白質(zhì)在其中的作用有待今后進一步研究。 4、差異蛋白質(zhì)ROC分析過程中發(fā)現(xiàn)，PAI-1、crosslaps、anti-p53 antibody以及t-PA在原發(fā)性股骨頭無菌性壞死患者與非ONFH人群的靜脈血中的含量始終存在顯著的差

12、異，而BGP及c-sis卻無統(tǒng)計學(xué)差異。PAI-1、crosslaps以及t-PA的特異性，敏感性及符合率都在70﹪以上，有一定的診斷意義，p53 antibody診斷意義其次，而BGP和c-sis則基本價值不大。 結(jié)論 1、采用優(yōu)化的雙向凝膠電泳技術(shù)可成功建立血漿蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，該方法的確立為尋找血漿疾病相關(guān)蛋白質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。 2、ONFH與正常人群在血漿蛋白表達譜之間存在差異。其中PAI-1、crossl

13、aps以及anti-p53 antibody在ONFH血漿中的表達升高，而蛋白質(zhì)t-PA， BGP和c-sis在ONFH血漿中的表達下調(diào)。 3、差異蛋白質(zhì)的存在提示ONFH的病理機制與血液凝血異常、原癌基因及抑癌基因調(diào)空失衡導(dǎo)致的細胞凋亡異常、成骨細胞活動下降導(dǎo)致的BGP合成和分泌減少以及骨基質(zhì)-Ⅰ型膠原代謝異常有關(guān)。 4、PAI-1、crosslaps、anti-p53 antibody以及t-PA作為潛在的ONFH血