不同傳代自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療股骨頭無菌性壞死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、股骨頭缺血性壞死（avascular necrosis of femoral head, ANFH）是一種常見的骨壞死性疾病，與多種致病因素有關(guān)，可能存在多種發(fā)病機(jī)制。目前在ANFH的不同時期治療方法多種多樣，治療方法的選擇及其療效也還存在很大爭議。理想的治療應(yīng)在早期階段，目的主要是阻止骨質(zhì)繼續(xù)壞死，促進(jìn)骨再生，改善股骨頭內(nèi)血液循環(huán)，恢復(fù)股骨頭的解剖和組織結(jié)構(gòu)，防止塌陷，改善臨床癥狀，恢復(fù)功能，延緩進(jìn)行人工髖關(guān)節(jié)置換的時間。然而早期AN

2、FH治療方法雖多，但效果均不理想。近年來研究發(fā)現(xiàn)ANFH病人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchamal stem cells, BMSCs）數(shù)目下降，活力降低，認(rèn)為ANFH可能是一種BMSCs減少性疾病，但目前尚缺乏利用培養(yǎng)的BMSCs移植治療ANFH的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。BMSCs具有高度增殖和多向分化潛能，經(jīng)定向誘導(dǎo)可分化為骨、軟骨、神經(jīng)細(xì)胞等，目前已成為骨組織工程技術(shù)研究中最為重要的種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)研究就BMSC

3、s的體外分離培養(yǎng)、擴(kuò)增、誘導(dǎo)其向成骨方向分化及其移植對ANFH的治療作用進(jìn)行觀察和分析，同時觀察比較不同傳代自體BMSCs移植治療ANFH的效果，旨在探討自體BMSCs移植對ANFH的治療作用、修復(fù)機(jī)理以及合理的治療方法，期望對進(jìn)一步的臨床應(yīng)用有所指導(dǎo)和幫助。
　　 目的：1）對兔BMSCs進(jìn)行體外分離培養(yǎng)、擴(kuò)增和向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，觀察其生長規(guī)律、生物學(xué)特性和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)并進(jìn)行成骨細(xì)胞鑒定；2）采用液氮冷凍法建立兔ANFH疾病動物

4、模型，觀察股骨頭的壞死和自然修復(fù)過程，為后續(xù)的自體BMSCs移植治療ANFH的實(shí)驗(yàn)研究建立疾病動物模型的基礎(chǔ)；3）體外培養(yǎng)、擴(kuò)增并向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的不同傳代的自體BMSCs采用經(jīng)皮穿刺方法移植到經(jīng)液氮冷凍法建立的ANFH兔股骨頭中，對其治療作用進(jìn)行觀察和分析比較，期望對進(jìn)一步的臨床應(yīng)用有所指導(dǎo)和幫助。
　　 方法：第一部分實(shí)驗(yàn)研究：抽取兔骨髓后通過全骨髓培養(yǎng)及貼壁篩選法對BMSCs進(jìn)行體外分離培養(yǎng)、傳代、擴(kuò)增和向成骨細(xì)胞方向誘

5、導(dǎo)分化，利用倒置相差顯微鏡、光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察其生長規(guī)律、生物學(xué)特性和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，繪制原代及傳代BMSCs的生長曲線；BMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后分別采用改良的Gonori鈣鈷法進(jìn)行堿性磷酸酶組織化學(xué)染色觀察及采用Von Kossa染色檢測兔BMSCs的鈣化結(jié)節(jié)。第二部分實(shí)驗(yàn)研究：10只成年新西蘭兔麻醉后通過手術(shù)切開顯露股骨頭負(fù)重區(qū)后采用液氮冷凍法制作ANFH疾病動物模型，術(shù)后觀察兔一般情況變化；分別于術(shù)后5天、2周、4周、8

6、周及12周以耳緣靜脈空氣栓塞法各處死2只兔后立即拍攝雙側(cè)髖關(guān)節(jié)正位X線片后，獲取兔股骨頭做大體解剖、形態(tài)學(xué)觀察，再制作H.E染色病理切片對股骨頭的壞死及修復(fù)情況進(jìn)行組織病理學(xué)觀察并對空骨陷窩率進(jìn)行測定。第三部分實(shí)驗(yàn)研究：40只成年新西蘭兔隨機(jī)分成A，B，C，D，E五個組，每組8只兔。A組為單純造模對照組，B組為造模后原代自體BMSCs移植治療組，C組為造模后一代自體BMSCs移植治療組，D組為造模后二代自體BMSCs移植治療組，E組為造

7、模后三代自體BMSCs移植治療組。所有各組全部采用液氮冷凍股骨頭負(fù)重區(qū)的方法制作ANFH疾病動物模型。各治療組實(shí)驗(yàn)動物于造模后5天分別將不同傳代和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后的自體BMSCs在X光機(jī)透視監(jiān)視下采用經(jīng)皮穿刺法移植到兔的壞死股骨頭中。對照組及各實(shí)驗(yàn)組分別于造模及自體BMSCs移植術(shù)后2周、4周、8周及12周采用空氣栓塞法各處死2只動物，進(jìn)行股骨頭標(biāo)本的大體解剖形態(tài)學(xué)觀察、X線攝片檢查、光鏡病理組織學(xué)觀察分析以及電鏡組織學(xué)觀察分析。各組療效

8、評價還進(jìn)一步采用病理圖像分析軟件對股骨頭冠狀截面骨小梁體積百分比、股骨頭冠狀截面血管密度和空骨陷窩陽性數(shù)等定量指標(biāo)進(jìn)行計算、統(tǒng)計學(xué)分析和評價。各組之間比較的統(tǒng)計分析方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包做兩因素連續(xù)測量資料的方差分析，統(tǒng)計檢驗(yàn)的顯著性水平α值取0.05。
　　 結(jié)果：第一部分實(shí)驗(yàn)研究：經(jīng)全骨髓貼壁篩選法培養(yǎng)后，兔原代BMSCs生長相對較緩慢，呈放射狀克隆集落貼壁生長。消化傳代培養(yǎng)后生長速度加快，細(xì)胞呈長梭形分散排列

9、，生長較均勻一致，無原代細(xì)胞生長的集落形成。多次傳代培養(yǎng)后細(xì)胞呈更均勻有序的分布，仍增殖旺盛。堿性磷酸酶組織化學(xué)染色呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，鈣化結(jié)節(jié)呈陰性反應(yīng)。經(jīng)向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMSCs生長旺盛，形體飽滿，體積逐漸增大，呈魚群樣排列。堿性磷酸酶組織化學(xué)染色和鈣化結(jié)節(jié)檢測均呈陽性反應(yīng)。掃描電鏡觀察顯示，BMSCs呈長梭形，大部分細(xì)胞為單核。經(jīng)過向成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)后，細(xì)胞體積增大，胞漿更為豐富，細(xì)胞呈現(xiàn)雙核增多現(xiàn)象。透射電鏡觀察顯示，未經(jīng)成骨誘

10、導(dǎo)的BMSCs以低電子密度為主，細(xì)胞核不規(guī)則，細(xì)胞間無明顯連接結(jié)構(gòu)。經(jīng)過誘導(dǎo)后的BMSCs以高電子密度為主，細(xì)胞間出現(xiàn)縫隙連接，細(xì)胞器更為豐富，分泌小泡及髓樣結(jié)構(gòu)大量增加，細(xì)胞核常呈圓形或橢圓形。第二部分實(shí)驗(yàn)研究：采用液氮冷凍股骨頭負(fù)重區(qū)的方法，成功制作出了ANFH的動物模型，所有標(biāo)本在影像學(xué)與組織學(xué)上均表現(xiàn)出骨壞死與修復(fù)過程。影像學(xué)上，造模后5天股骨頭密度及骨小梁結(jié)果仍基本正常，術(shù)后2周時骨密度減低，4周后骨密度逐漸開始增加，并出現(xiàn)骨

11、小梁結(jié)構(gòu)紊亂和囊性變，這些現(xiàn)象在造模后4周時最顯著；術(shù)后12周時骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂和囊性變程度減輕。在組織學(xué)上，造模術(shù)后5天，液氮冷凍區(qū)及其周圍的軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和骨髓組織呈現(xiàn)壞死，表現(xiàn)為骨陷窩內(nèi)骨細(xì)胞輪廓消失，細(xì)胞核固縮，骨陷窩空虛，空骨陷窩率最低70%，最高92%，髓腔充滿壞死的組織碎片，骨小梁結(jié)構(gòu)正常。術(shù)后4周時修復(fù)過程開始，8周時新生骨開始形成，12周時新生骨形成增多，修復(fù)已經(jīng)達(dá)到軟骨下骨板。第三部分實(shí)驗(yàn)研究：經(jīng)皮穿刺不同傳代并成骨

12、誘導(dǎo)的自體BMSCs移植治療后不同時間點(diǎn)觀察發(fā)現(xiàn)B、C、D、E組大多數(shù)動物活動度增加及行走姿勢好轉(zhuǎn)時間均較A組縮短。X線片檢查發(fā)現(xiàn)B、C、D、E組股骨頭壞死的修復(fù)作用均較對照組強(qiáng)，修復(fù)時間縮短。對股骨頭標(biāo)本的大體解剖、形態(tài)學(xué)觀察亦有著相同的發(fā)現(xiàn)。各組的光鏡組織病理學(xué)變化及電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察都有壞死和修復(fù)現(xiàn)象，但B、C、D、E組較A組修復(fù)的時間更快，修復(fù)程度更好。利用均值對各實(shí)驗(yàn)組及各觀察時間點(diǎn)的股骨頭冠狀截面骨小梁體積百分比、血管密度及空

13、骨陷窩計數(shù)分別進(jìn)行兩因素連續(xù)測量資料的總體方差分析，結(jié)果均有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，并且在各實(shí)驗(yàn)因素和觀察時間點(diǎn)之間沒有交互作用。對照組及各實(shí)驗(yàn)組股骨頭冠狀截面骨小梁體積百分比之間進(jìn)行兩兩比較，只有對照組和二代自體BMSCs移植組之間具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.043），雖然第三代自體BMSCs移植組和對照組之間差異沒有達(dá)到統(tǒng)計學(xué)顯著性（0.087），但第二代和第三代自體BMSCs移植組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P=1.00）。從平均數(shù)看，第三代

14、自體BMSCs移植治療組的骨小梁生長情況僅次于第二代BMSCs移植組。骨小梁體積百分比變化曲線圖顯示，對照組的骨小梁體積百分比一直處于低水平，恢復(fù)較慢；而第二代自體BMSCs移植組的骨小梁體積百分比較高，且在第四周之后恢復(fù)較快，生長良好。
　　 結(jié)論：第一部分實(shí)驗(yàn)研究：全骨髓培養(yǎng)和貼壁篩選法操作簡單、成本低廉、對細(xì)胞損傷小，可以作為獲得和擴(kuò)增BMSCs的可靠方法。BMSCs在體外可以通過定向誘導(dǎo)促使其向成骨細(xì)胞分化，表達(dá)堿性磷酸

15、酶和鈣化結(jié)節(jié)。確定BMSCs可靠的方法是檢測其成骨誘導(dǎo)分化后產(chǎn)生的礦化或鈣化結(jié)節(jié)，主要通過Von Kossa染色識別。BMSCs在體外經(jīng)過向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)后細(xì)胞器更為豐富，細(xì)胞間縫隙連接及大量的基質(zhì)小泡、髓樣結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)可能是BMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化后的超微結(jié)構(gòu)特征。第二部分實(shí)驗(yàn)研究：液氮冷凍法能夠成功復(fù)制兔ANFH疾病動物模型，其病理變化過程可以反映出人類ANFH的演變過程，是一個壞死程度和壞死時間可以控制的標(biāo)準(zhǔn)化的動物模型。本疾病動

16、物模型制作簡便易行，造模成功率高，成模周期短，動物死亡率低，可重復(fù)性強(qiáng)，ANFH后有自我修復(fù)反應(yīng)，可以作為股骨頭壞死治療研究的良好的疾病動物模型。第三部分實(shí)驗(yàn)研究：經(jīng)皮穿刺將預(yù)先分離培養(yǎng)并向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的不同傳代的自體BMSCs注入實(shí)驗(yàn)動物股骨頭壞死區(qū)，既降低了骨內(nèi)壓，又解決了BMSCs數(shù)量少、活性低的問題，從細(xì)胞水平上為骨的生長修復(fù)創(chuàng)造了條件。從治療后各項(xiàng)指標(biāo)觀察，總體上均顯示不同傳代的自體BMSCs移植對早期ANFH有較為確切的

17、治療作用。該方法操作簡便、創(chuàng)傷小，無排斥反應(yīng)，為早期ANFH的治療提供新的治療思路，有很大的臨床應(yīng)用潛力。進(jìn)一步用空骨陷窩計數(shù)、冠狀截面血管密度以及骨小梁體積百分比等定量指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，顯示二代自體BMSCs移植治療ANFH效果最好，其次為第三代自體BMSCs。在采用自體BMSCs移植修復(fù)ANFH時，應(yīng)盡可能提高BMSCs移植的的數(shù)量，這可以通過BMSCs多次傳代培養(yǎng)擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)，從而可提高其治療ANFH的效果。第二代和第三代自體BMSC