糖尿病大鼠腎臟炎癥相關(guān)因子的表達與意義及藥物干預研究.pdf

1、背景和目的：糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常見、最嚴重的慢性并發(fā)癥，隨著糖尿病發(fā)病率的逐年提高，DN已成為導致終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)的主要病因之一。由此帶來的透析、腎移植等治療費用在整個醫(yī)療支出中所占比例正在逐年提高，給病人和社會造成極大的經(jīng)濟負擔。其早期病理特征是腎小球肥大、基底膜增厚和腎小球系膜區(qū)細胞外基質(zhì)(extracelluar matrix

2、，ECM)堆積，晚期則表現(xiàn)為腎小球硬化和間質(zhì)纖維化。 N的病因和發(fā)病機制至今尚未完全闡明，近年來研究認為DN是在高血糖狀態(tài)下腎內(nèi)糖代謝紊亂與血流動力學因素共同參與、相互作用的結(jié)果，但從循證醫(yī)學的角度看，即使嚴格控制血糖、應用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI) 或血管緊張素II受體阻滯劑(angiotensin II receptor-blocker

3、，ARB)阻斷腎素一血管緊張素系統(tǒng)(renin—angiotensin system，RAS)僅對部分DN有一定的延緩作用，絕大部分患者仍然緩慢進展至終末期腎衰。很顯然，要進一步提高DN的防治水平，必須在現(xiàn)有治療措施的基礎(chǔ)上，探索新的治療手段，給予多途徑的綜合治療。晚近研究揭示DN的發(fā)病在代謝紊亂與血流動力學機制基礎(chǔ)上，炎癥機制是其持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素。DN早期對腎內(nèi)血液動力學改變方面起著非常重要作用的腎局部RAS在其后期的病程發(fā)展中的推

4、動作用與其觸發(fā)炎癥反應相關(guān)。已有研究證實，糖尿病處于一種慢性低水平的炎癥狀態(tài)，廣義的炎癥標志物囊括了各種免疫細胞、細胞因子等。其中單核巨噬細胞浸潤腎組織被認為是DN的重要病理特征，其作用機制涉及ECM積聚等諸多因素。而炎癥相關(guān)的細胞因子如：單核細胞趨化蛋白一1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、正常T細胞表達和分泌的活性調(diào)節(jié)蛋白 (regulated upon actiVatio

5、n normal T cell expressed and secreted，RANTES)、巨噬細胞移動抑制因子(macrophage emigration inhibitoryfaCtor，MIF)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑一l(tissue inhibitors 0fmetalloproteinases-1，TIMP-1)等與DN發(fā)生發(fā)展的關(guān)系還不清楚，是否可以作為DN發(fā)病的炎癥證據(jù)尚無定論，在糖尿病及其并發(fā)癥的藥物治療中，特異

6、性抗炎治療仍是一個空缺。到目前為止，國內(nèi)外未檢索到有人系統(tǒng)探討糖尿病大鼠腎臟MCP-1、RANTES、MIF、TIMP-1mRNA表達水平與ECM代謝、蛋白尿的形成及腎臟功能損害的程度等的相關(guān)關(guān)系及厄貝沙坦、心肝寶、霉酚酸酯等的藥物干預作用。 本課題應用STZ誘導的單側(cè)腎切除糖尿病大鼠模型，采用實時熒光定量PCR(real time fluorogeniC quantitative PCR．Real time FQ-PCR)方法

7、檢測單側(cè)腎切除糖尿病大鼠腎組織MCP-1、RANTES、MIF、TIMP-1等細胞因子mRNA的表達，并將表達水平與腎臟病理改變、腎功能損害的程度進行相關(guān)性研究。以期系統(tǒng)探討厄貝沙坦、心肝寶、霉酚酸酯對單側(cè)腎切除糖尿病大鼠腎臟MCP—1、RANTES、MIF等表達的影響，尋找糖尿病腎病炎癥證據(jù)，探討針對炎癥的靶向治療。本研究可進一步揭示DN發(fā)病的炎癥證據(jù)，為選擇性的針對炎癥的治療可能成為阻止DN進展的有效措施之一提供實驗依據(jù)，為延緩或逆

8、轉(zhuǎn)DN的進展提供新的方向，具有重要的理論意義和實用價值。 方法：72只雄性Wistar大鼠，適應喂養(yǎng)一周后，所有大鼠行右腎切除術(shù)。兩周后64只大鼠接受腹腔注射單劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)60mg/Kg，其余大鼠給予等劑量枸櫞酸緩沖液腹腔注射。設(shè)正常對照組(A)、糖尿病對照組(B)、糖尿病治療組(C)。治療組包括：厄貝沙坦治療組(C1)、心肝寶治療組(C2)霉酚酸酯治療組(C3)、及厄貝沙坦聯(lián)合心肝寶治

9、療組(C4)、厄貝沙坦聯(lián)合霉酚酸酯治療組(C5)。C1組厄貝沙坦25mg．kg<'-1>．d<'-1>、C2組心肝寶500mg．kg<'-1>．d<'-1>、C3組霉酚酸酯15mg.kg<'-1>．d<'-1>、C4組同C1、C2組，C5組同C1、C3組。第16周末處死全部大鼠，處死前收集大鼠24小時尿，檢測尿白蛋白排泄率(UAER)、尿肌酐；腹主動脈取血檢測血糖、血肌酐(Scr)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)，計算肌酐清除率(

10、Ccr)；取腎，剝離被膜，稱重，計算腎臟肥大指數(shù)(KW/BW)。部分腎組織用10％福爾馬林，石蠟切片，用于HE、PAS染色，醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)分析腎小球平均體積(MGV)和系膜面積比(FMA)；部分腎組織用2.5％戊二醛固定，制作電鏡片觀察電鏡下改變。部分腎組織經(jīng)液氮保存，用Real time FQ-PCR檢測MCP-1、RANTES、MIF、TIMP-1等細胞因子的mRNA表達情況。 結(jié)果：①第4、8、1 6周時，與A組大鼠相比，

11、各組糖尿病大鼠的體重均明顯減輕、血糖明顯升高(P<0.05)，而各糖尿病組之間的體重和血糖均無顯著差異(P>0.05)。 ②與A組相比，B組大鼠UAER于第8周時即顯著升高(14.00倍)；16周時，UAER仍持續(xù)上升(25.86倍)，比第8周時升高95％。各治療組與B組相比，UAER均有不同程度的下降(P<0.05)。其中，以C4、C5組下降最明顯(P<0.05)。第l6周時，B組大鼠的Scr比A組明顯增高(114％，P<0

12、.05)，各治療組與B組相比，Scr均有顯著下降(P<0.05)。且與A組大鼠的Scr水平相當(P<0.05)。同時，B組大鼠的Ccr與A組相比，已開始下降(15.3％，P<0.05)。各治療組大鼠的Ccr卻仍高于A組(P<0.05)。 ③第16周時，B組大鼠TG、TC水平比A組明顯升高(P<0.05)。與B組相比，治療組大鼠的TG、TC均有下降(P<0.05)。與A組TG、TC水平相當。C2組、C4組血脂下降最明顯且與其他治

13、療組比較有顯著性差異(P<0.05)。 ④第16周時，與A組相比，B組大鼠Kw/BW、MGV、FMA均明顯增大(分別為84％、62％、1 79％)。各治療組與B組相比KW/BW、MGV、FMA均有不同程度的下降(P<0.05)。但仍高于A組(P<0.05)。其中，以C4、C5組下降最明顯(P<0.05)。其余組之間無顯著差異(P<0.05)。 ⑤第1 6周時，與A組相比，各組糖尿病大鼠腎臟MCP-1、RANTES、M

14、IF、TIMP-1的mRNA表達均明顯升高(P<0.01)。B組大鼠腎臟MCP-1、RANTES、MIF、TIMP-1的mRNA表達升高幅度分別達33.91倍、19.08倍、194.2倍、25.7倍。與B組相比，各治療組大鼠腎臟MCP-1、RANTES、MI F、TIMP-1的mRNA表達均有不同程度下調(diào)(p<0.05)。 ⑥第16周時，B組大鼠腎臟FMA與Ccr成負相關(guān)(r=-0.796，p<0.05)腎臟MCP-1、RANT

15、ES、MIF、TIMP-1的mRNA表達水平與UAER、KW/BW、MGV和FMA均成正相關(guān)。 結(jié)論：①DN大鼠腎臟MCP-1、RANTES、MIF、TIMP-1等炎癥相關(guān)的細胞因子表達水平顯著升高，是DN炎癥相關(guān)的直接證據(jù)。 ②DN大鼠腎臟肥大、系膜ECM沉積以及UAER增加均與腎臟MCP-1、RANTES、MI F、TIMP-1等細胞因子的高表達有關(guān)。提示炎癥參與了DN腎臟病理改變和腎功能損害的發(fā)生和發(fā)展。

16、 ③DN時，腎臟MCP-1，RANTES，MIF，TIMP-lmRNA表達增高，可引起ECM沉積，系膜擴張和腎小球濾過面積減少，腎小球濾過率下降。提示DN晚期炎癥引起的ECM成分在GBM和系膜區(qū)過度積聚導致的GBM增厚和系膜基質(zhì)擴張是引起糖尿病蛋白尿與進行性腎功能減退的重要因素。 ④厄貝沙坦、心肝寶和霉酚酸酯均可下調(diào)腎臟MCP-1、RANTES、MIF、TIMP-1等細胞因子mRNA的表達，從而減少ECM沉積、抑制腎臟肥大、降低

17、尿蛋白，防止DN的發(fā)生發(fā)展。提示霉酚酸酯對DN有特異性抗炎作用，厄貝沙坦、心肝寶可通過非特異性抗炎作用對DN產(chǎn)生保護作用。另外，心肝寶對DN脂代謝紊亂有顯著調(diào)節(jié)作用。 ⑤厄貝沙坦、心肝寶和霉酚酸酯在防治DN時的療效相當。但厄貝沙坦對腎臟MIF表達的抑制作用較強，而心肝寶對腎臟TIMP-1表達的抑制作用較強，霉酚酸酯主要對腎臟MCP-1表達的抑制作用較強。部分揭示了厄貝沙坦、心肝寶和霉酚酸酯對糖尿病腎病保護作用的分子機制。