組織工程人工肌肉生物學特性的改善及PLG生物支架作為骨骼肌細胞載體的應用研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：組織工程人工肌肉的構建與評價及神經(jīng)支配特性的改進
　　 目的：體外構建組織工程人工肌肉，并分析組織工程人工肌肉中肌球蛋白重鏈亞型（MHC）表達情況。為進一步提高人工肌肉對神經(jīng)遞質(zhì)的敏感性，我們嘗試上調(diào)乙酰膽堿受體在人工肌肉表面的數(shù)目并誘導人工肌肉形成形態(tài)成熟的乙酰膽堿受體。
　　 方法：將表達綠色熒光蛋白的C3H小鼠原代成肌細胞與120 μl Fibrin 水凝膠混合，體外構建

2、人工肌肉。利用實時定量PCR對平面培養(yǎng)細胞和組織工程人工肌肉中的MHC 亞型進行分析。利用Agrin 蛋白上調(diào)乙酰膽堿受體在人工肌肉表面的數(shù)目。用Laminin 蛋白在人工肌肉表面誘導形成形態(tài)成熟的乙酰膽堿受體。并用激光共聚焦顯微鏡計數(shù)乙酰膽堿受體數(shù)目，觀察乙酰膽堿受體形態(tài)。
　　 結果：未經(jīng)過任何處理的組織工程人工肌肉的MHC 亞型處于胚胎期和成熟期之間，相當于圍周期（perinatal）的發(fā)育水平。平面培養(yǎng)的細胞中MHC 亞

3、型為胚胎期水平。Agrin 蛋白誘導，增加了乙酰膽堿受體在人工肌肉表面的數(shù)目。Laminin 蛋白處理，改善了乙酰膽堿受體的結構，形成形態(tài)成熟乙酰膽堿受體。
　　 結論：從發(fā)育學意義上看，人工組織肌肉表達更加成熟的MHC 亞型，更類似成熟肌肉組織。Agrin 蛋白誘導成功增加乙酰膽堿受體數(shù)目。Laminin 蛋白誘導,改善了乙酰膽堿受體的結構，使之變得更加成熟有利于更多神經(jīng)突觸的形成，進一步提高了人工組織肌肉在神經(jīng)生物學上的結構

4、優(yōu)勢，為在人工肌肉中引入神經(jīng)分布奠定了基礎。
　　 第二部分：VEGF 改善組織工程人工肌肉周圍血管網(wǎng)絡分布的研究
　　 目的：改善人工組織工程肌肉的生物特性，增加其周圍血管生成，達到增強其與宿主循環(huán)系統(tǒng)營養(yǎng)與代謝交流的目的，使之在移植后更好與宿主整合，長期生存，在宿主體內(nèi)發(fā)揮作用。
　　 方法：逆轉(zhuǎn)錄病毒感染成肌細胞，使其分別表達VEGF和GFP。用分化培養(yǎng)液，體外融合表達VEGF和GFP的成肌細胞，以形成雜交

5、人工肌肉。用共聚焦顯微鏡觀察雜交人工肌肉組織形態(tài)和結構，以及移植前后細胞存活率。用免疫酶連反應檢測VEGF含量。用伊文思藍染色評價人工肌肉周圍血管網(wǎng)絡形成情況。
　　 結果：表達VEGF的細胞可在分化條件下分化為成熟肌細胞，并形成肌纖維，肌細胞分化過程不受VEGF 生長因子表達的抑制。用這種細胞在體外成功構建組織工程人工肌肉，結構形態(tài)與生理狀態(tài)下的肌肉相似。VEGF的表達不影響雜交人工肌肉中肌細胞的存活率。調(diào)節(jié)雜交比例可調(diào)節(jié)VE

6、GF的生成量。移植到小鼠皮下之后，表達VEGF的人工肌肉明顯增加人工肌肉周圍血管網(wǎng)絡的生成，提高肌細胞的存活率。
　　 結論：肌細胞分泌的VEGF可在移植區(qū)域強烈促進局部微血管生成，這種影響可持續(xù)幾個月，為其移植后與宿主整合提供了生理基礎，也有利于肌細胞所表達的治療性蛋白盡可能多進入血液循環(huán)，在宿主體內(nèi)發(fā)揮有效作用。
　　 第三部分：PLG 生物支架作為骨骼肌細胞載體的研究及NK細胞移除對支架上肌細胞體內(nèi)存活率的影響

7、r>　　 目的：評價人工合成的可降解生物支架PLG作為成骨骼肌細胞載體的效果，以及去除裸鼠NK細胞對PLG 支架上成熟肌細胞成活率的影響。
　　 方法：利用高壓氣泡法成功制備可降解的多孔PLG 生物支架。將人類原代骨骼成肌細胞接種至PLG 生物支架上，檢測成肌細胞在PLG 支架是否可體外分化為成熟肌細胞。將接種肌細胞的PLG 生物支架移植至免疫缺陷型小鼠體內(nèi)，觀察肌細胞在體內(nèi)存活率。利用抗NK細胞抗體去除裸鼠體內(nèi)NK細胞，檢測

8、去除NK細胞后，PLG生物支架上肌細胞的存活率。
　　 結果：成功制備PLG 生物支架。成肌細胞可在PLG 生物支架上分化為成熟肌細胞。與無張力組相比，PLG 支架顯著提供肌細胞在體存活率。PLG 在移植四周后，PLG生物支架上的肌細胞密度降低了78%。去除裸鼠體內(nèi)NK細胞的影響，在第4 周，肌纖維中肌細胞的存活率達34.72%，遠高于未去除NK細胞組的存活率22.72%。經(jīng)過NK細胞抗體處理過的動物肌纖維綠色熒光強度比未經(jīng)過處