大鼠C6膠質(zhì)瘤全顱放療后血腦屏障通透性改變與Claudin-5蛋白檢測(cè).pdf

1、[研究目的]: 研究C6腦膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)的不同區(qū)域BBB通透性的改變，及不同劑量單次全腦放射線照射后早期大鼠BBB通透性的動(dòng)態(tài)變化，從微血管超微結(jié)構(gòu)特征和緊密連接蛋白Claudin-5探討B(tài)BB/BBTB通透性增高的主要途徑及其開放的變化情況，研究和探討放療與血腦屏障開放規(guī)律的關(guān)系，為指導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤放療提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)和可能的適時(shí)介入化療的劑量域及時(shí)間域。 [材料方法]: （1）采用立體定向方法在大鼠右側(cè)尾狀核接種10

2、μl含1×106膠質(zhì)瘤細(xì)胞，建立大鼠C6膠質(zhì)瘤模型20只。觀察大鼠的生存狀態(tài)、記錄生存時(shí)間，接種后第10、14、20天分別行MRI增強(qiáng)掃描。評(píng)價(jià)此方法膠質(zhì)瘤模型成瘤率、瘤體大小變化情況、瘤生長持續(xù)時(shí)間，為后續(xù)研究提供穩(wěn)定的膠質(zhì)瘤模型來源。 （2）空白組和荷瘤組大鼠各5只，荷瘤鼠于建模后第20天取腫瘤處、腫瘤臨近處（brain adjacent to tumor，BAT）即距腫瘤邊界2mm以內(nèi)及腫瘤遠(yuǎn)隔處（brain distan

3、t to tumor，BDT）即2mm以外的大腦半球腦皮質(zhì)3個(gè)部位的腦組織和空白鼠右側(cè)尾狀核正常腦組織，采用外源性硝酸鑭透射電鏡示蹤法，觀察BBB/BBTB超微結(jié)構(gòu)特征及硝酸鑭滲出情況，判定BBB破壞程度。 （3）空白組和荷瘤組（建模后20天）大鼠各5只，經(jīng)免疫組化法測(cè)定緊密連接蛋白claudin-5在空白鼠和荷瘤鼠上述各部位的表達(dá)情況。 （4）荷瘤鼠（建模后17天）120只，隨機(jī)分為5組，即假照射組、5Gy、10Gy、

4、15Gy、20Gy組，行相應(yīng)劑量全腦放射線單次照射。其中假照射組（來源于第一、二部分試驗(yàn)），5Gy、10Gy和20Gy組各20只，于照射后1d處死8只，各4只分別行硝酸鑭透射電鏡示蹤法觀察BAT處BBB/BBTB通透性及免疫組化法測(cè)定緊密連接蛋白claudin-5的變化研究；15Gy組60只，分別于照射后1d、3d、7d、14d、21d、28d各處死8只進(jìn)行上述相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)；每組剩余12只至自然死亡。觀察并記錄各照射組大鼠的生存狀態(tài)、

5、生存時(shí)間。 [結(jié)果]: （1）SD大鼠右側(cè)尾狀核立體定向方法建立的C6腦膠質(zhì)瘤模型確切可靠，成瘤率達(dá)97%以上，未見遠(yuǎn)處及顱外轉(zhuǎn)移。荷瘤大鼠的早期癥狀包括運(yùn)動(dòng)減少，攻擊性減弱和精神萎靡等，晚期則有偏癱、眶周出血、癲癇和惡液質(zhì)等表現(xiàn)，大鼠體重進(jìn)行性減輕。MRI檢查見腫瘤呈圓形或類圓形，呈長T1低信號(hào)和長T2高信號(hào)，大多呈環(huán)狀強(qiáng)化。 （2）硝酸鑭示蹤電鏡觀察C6膠質(zhì)瘤荷瘤鼠：腫瘤處可見La3+通過血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連

6、接及基底膜廣泛滲透至血管腔外及腦組織間隙內(nèi)，部分毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞失去正常形態(tài)，結(jié)構(gòu)破壞，大量La3+沉積在細(xì)胞核內(nèi)、外；BAT處見La3+滲出至局部BM，大部分停滯在血管腔內(nèi)，未見La3+滲透至血管外腦組織間隙內(nèi)；BDT及對(duì)照組NBT處La3+分布在血管腔內(nèi)，血管內(nèi)皮細(xì)胞TJ結(jié)構(gòu)完整，基底膜呈線狀連續(xù)，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞漿均未見La3+，血管腔外未見鑭顆粒沉積。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析硝酸鑭滲出顯示：腫瘤處>BAT>BDT、NBT（P<0.05

7、），而BDT、NBT兩組結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 （3）硝酸鑭示蹤電鏡觀察各不同劑量照射組荷瘤鼠BAT處BBB通透性：5Gy組荷瘤鼠BAT處見La3+滲出至局部基底膜，大部分分布在血管腔內(nèi)，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯異常；10Gy組BAT處可見La3+滲出至廣泛基底膜，滲出量增加，緊密連接開放，細(xì)小的高電子密度鑭顆粒滲出至腦組織間隙，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，部分滯留在血管腔內(nèi)；15Gy、20Gy組BAT處均可見La3+滲出至基底膜、血管腔外、腦組織間

8、隙內(nèi)及細(xì)胞內(nèi)，內(nèi)皮細(xì)胞腫大，腦組織水腫。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析硝酸鑭滲出顯示：20Gy、15Gy>10Gy>5Gy、0Gy（P<0.05），而0Gy、5Gy兩組間及15Gy、20Gy兩組間結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 （4）硝酸鑭示蹤電鏡觀察15Gy組照射后不同時(shí)間點(diǎn)荷瘤鼠BAT處BBB通透性變化：照射后第1、3天La3+滲出至基底膜、血管腔外、腦組織間隙內(nèi)及細(xì)胞內(nèi)，少許殘留在血管腔內(nèi)；第7天為La3+滲出至基底膜，腦組織間隙內(nèi)見細(xì)小的鑭顆粒，但細(xì)胞

9、內(nèi)未見滲出，較前減弱；第14天為La3+滲出至局部基底膜，血管腔外、腦組織間隙內(nèi)及細(xì)胞內(nèi)均未見鑭顆粒沉積，大部分滯留在血管腔內(nèi)；第21、28天均為La3+僅分布在血管腔內(nèi)，未見滲出至基底膜、血管腔外及腦間質(zhì)裂隙內(nèi)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析硝酸鑭滲出顯示：1d、3d>7d>14d>21d、28d（P<0.05），而1d、3d兩組結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，21d、28d兩組結(jié)果完全相同。 （5）緊密連接蛋白claudin-5在空白鼠和荷瘤鼠腦組織中均沿血

10、管內(nèi)皮細(xì)胞漿呈棕黃色或棕褐色陽性表達(dá)。對(duì)照組腦組織claudin-5的表達(dá)豐富、連續(xù)，呈中-強(qiáng)度表達(dá)，沿血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿見棕黃色強(qiáng)染色；荷瘤組大鼠腫瘤處claudin-5表達(dá)減弱，呈輕度表達(dá)，沿血管呈間斷表達(dá)；BAT較對(duì)照組腦組織表達(dá)下降，呈中度表達(dá)，血管扭曲、變形，但仍呈連續(xù)狀態(tài)；BDT與對(duì)照組正常腦組織claudin-5表達(dá)相仿。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析claudin-5表達(dá)顯示：腫瘤處>BAT>BDT、NBT（P<0.05），而BDT、NBT兩

11、組結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 （6）緊密連接蛋白claudin-5在各不同劑量照射組荷瘤鼠BAT處的表達(dá)變化：5Gy組荷瘤鼠BAT處見較對(duì)照組腦組織表達(dá)下降，仍呈中度表達(dá)，血管扭曲、變形，但仍呈連續(xù)狀態(tài)；10Gy組BAT處可見較對(duì)照組腦組織表達(dá)下降，呈輕中度表達(dá)，血管扭曲、變形與間斷表達(dá)狀態(tài)并存；15Gy、20Gy組BAT處均可見較對(duì)照組腦組織表達(dá)下降，呈輕度表達(dá)，沿血管間斷表達(dá)，并見碎片狀。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：20Gy、15Gy>10Gy>5

12、Gy、0Gy（P<0.05），而0Gy、5Gy兩組間與15Gy、20Gy兩組間結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 （7）緊密連接蛋白claudin-5在15Gy組照射后不同時(shí)間點(diǎn)荷瘤鼠BAT處的表達(dá)變化：照射后1d、3d緊密連接蛋白claudin-5呈輕度表達(dá)，沿血管間斷表達(dá)，并呈碎片狀表達(dá)；照射后第7d為輕中度表達(dá)，血管扭曲、變形與間斷表達(dá)狀態(tài)并存；照射后第14d為中度表達(dá)，血管扭曲、變形，但仍呈連續(xù)狀態(tài)：照射后第21d、28天為中強(qiáng)度表達(dá)，

13、出現(xiàn)部分小血管閉塞，出現(xiàn)連續(xù)與碎片表達(dá)并存。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：1d、3d>7d>14d>21d、28d（P<0.05），而1d、3d兩組間與21d、28d兩組間結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 （8）C6膠質(zhì)瘤腫瘤組織、BAT、NBT三個(gè)區(qū)域的硝酸鑭滲出與claudin-5表達(dá)兩者之間呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為rs=-0.599，P=0.04。腫瘤BAT處不同劑量放療1d后及15Gy照射后不同時(shí)間點(diǎn)的硝酸鑭滲出程度與claudin-5表達(dá)均呈顯著負(fù)相關(guān)，

14、相關(guān)系數(shù)分別為rs=-0.678，P=0.001和rs=-0.571，P=0.004。 （9）各組大鼠的生存時(shí)間：假照射組、5Gy組、10Gy組、15Gy組、20Gy組的MeST分別為24d、30.5d、37.5d、49d、63d，各組的MST分別為24.3±3.7d、33.0±7.4d、39.8±10.0d、65.3±47.1d、84.4±58.8d；四個(gè)照射組MeST的%ILS分別為27.1%、56.3%、104.2%、16

15、2.5%，各組MST的%ILS分別為35.8%、63.8%、168.7%、247.2%。四個(gè)照射組的生存期與假照射組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。 [結(jié)論]: （1）大鼠C6膠質(zhì)瘤模型建立成功，接種后顱內(nèi)腫瘤呈浸潤性生長，與人腦膠質(zhì)瘤具有相似性。腦內(nèi)接種1×106個(gè)C6細(xì)胞建立的模型用于治療實(shí)驗(yàn)研究時(shí)，治療處理時(shí)間以細(xì)胞接種后第2～3周為宜。 （2）C6膠質(zhì)瘤微血管超微結(jié)構(gòu)改變是血腦屏障開放的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，緊

16、密連接開放是微血管通透性提高的主要原因。 （3）C6膠質(zhì)瘤不同區(qū)域內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)改變與屏障功能破壞程度不一，距離腫瘤處越近，硝酸鑭滲出越明顯，claudin-5表達(dá)越低，細(xì)胞間TJ破壞越重，與微血管通透性增加呈正相關(guān)；在BDT處似正常腦組織，血腦屏障穩(wěn)定，硝酸鑭不滲出，claudin-5表達(dá)豐富，通透性最低；腫瘤的周邊存在不同程度的屏障，說明腫瘤存在周邊屏障。 （4）C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的直接浸潤可以降低內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白cl

17、audin-5的表達(dá)，claudin-5從細(xì)胞處丟失是TJ開放的分子基礎(chǔ)，可能是誘導(dǎo)TJ破壞導(dǎo)致BBTB通透性增高的重要原因。 （5）受照大鼠BBB均出現(xiàn)病理改變，放療后大鼠claudin-5的表達(dá)進(jìn)一步降低，說明放射線可致血腦屏障的緊密連接破壞增加，具有降低及破壞BBB功能的作用。 （6）C6膠質(zhì)瘤腫瘤組織、BAT、NBT三個(gè)區(qū)域的硝酸鑭滲出與claudin-5表達(dá)兩者之間呈顯著負(fù)相關(guān)，荷瘤鼠不同劑量放療后1d及15G