大鼠骨髓基質(zhì)干細胞治療C6膠質(zhì)瘤的實驗研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，約占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的40％，成侵襲性生長，不易完全切除，術(shù)后易復發(fā)，預后差。干細胞在特定環(huán)境下，可以向腫瘤或損傷區(qū)域遷移運動，干細胞的移植可靶向性的治療疾病。骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCc)是存在于骨髓中的具有自我更新和多向分化潛能的非造血干細胞，可誘導分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、表皮細胞、心肌細胞和神經(jīng)細胞等；而且其培養(yǎng)技術(shù)和條件相對簡單，來源廣、取材容易、傳代穩(wěn)定，避開了免疫排斥和倫理障礙，是干細胞研

2、究中的新秀。BMSCs與其它干細胞一樣可以分泌細胞營養(yǎng)因子和細胞活素類物質(zhì)，如干細胞因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、白介素及干擾素等；BMSCs的多向分化潛能可以促進病變區(qū)域的功能恢復，同時向病變部位遷移；而且有研究證實BMSCs可以進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)而不受到血腦屏障的影響。本研究通過其對在體內(nèi)體外C6膠質(zhì)瘤細胞的生長情況和治療效果進行觀察，為骨髓基質(zhì)干細胞在顱內(nèi)病變時行細胞的替代治療做探索性研究。
　　1.大鼠骨髓基質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定和

3、標記
　　目的：通過穩(wěn)定可靠的骨髓基質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)模型（全細胞培養(yǎng)法）培養(yǎng)擴增獲得純化的骨髓基質(zhì)干細胞，為進一步的實驗奠定基礎。方法：無菌取SD大鼠骨髓液并移至培養(yǎng)瓶，加入DMED/F12+10％FBS培養(yǎng)液，原代靜置培養(yǎng)48h后半量換液；以后正常換液，待細胞鋪滿瓶底80％左右時進行傳代。第4代細胞形態(tài)較為均一，MTT法測定細胞活性和繪制生長曲線，流式細胞術(shù)檢測BMSCs表面標記CD14、CD34、CD45、CD29、CD90、

4、CD105表達率。結(jié)果：在培養(yǎng)初期可見大量懸浮細胞，48h后可見有散在紡錘形或梭形貼壁細胞；第4代后細胞呈形態(tài)均一的紡錘形或梭形，分布均勻。細胞生長曲線可見細胞呈一種持續(xù)的增殖狀態(tài)，培養(yǎng)4－6天后進入對數(shù)生長期。行流式細胞技術(shù)檢測細胞表面抗原標記，顯示為體形均一的細胞群，CD14、CD34、CD45的表達率分別為2.4％、1.6％、2.7％，為陰性；CD29、CD90、CD105的陽性率分別為98.9％、99.5％、99.1％，為陽性。

5、結(jié)論：通過體外骨髓的全細胞培養(yǎng)的方法可獲得高純度的BMSCs，并可在體外穩(wěn)定培養(yǎng)。
　　2.體外鼠BMSCs對C6膠質(zhì)瘤細胞的趨向性及抑制作用
　　目的：探討B(tài)MSCs在體外微環(huán)境下對C6膠質(zhì)瘤細胞的趨向性，并初步研究BMSCs在體外微環(huán)境下對C6膠質(zhì)瘤細胞增殖的抑制作用。方法：BMSCs與C6膠質(zhì)瘤細胞以Transwell法共培養(yǎng)72h，對遷移的BMSCs行HE染色并對C6膠質(zhì)瘤細胞行Weston法檢測細胞凋亡；每12h對

6、C6膠質(zhì)瘤細胞行MTT法繪制細胞生長曲線。結(jié)果：遷移的BMScs行HE染色示Transwell培養(yǎng)板小室下面存在大量的遷移細胞；WestonBlot檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，共培養(yǎng)組C6細胞的抗凋亡蛋白Bcl2表達水平明顯下降，同時促凋亡蛋白Caspase3表達水平明顯升高（P<0.01）；MTT法繪制生長曲線示實驗組較對照組的C6膠質(zhì)瘤細胞生長增殖抑制（P＜0.05）。結(jié)論：BMSCs在體外微環(huán)境下對C6膠質(zhì)瘤細胞具有明顯的趨向性，

7、可能影響C6膠質(zhì)瘤細胞生存的微環(huán)境，也可以用來作為目的基因或藥物的載體；BMSCs在體外微環(huán)境下對C6膠質(zhì)瘤細胞存在抑制生長的作用，流式細胞法檢測比較明顯，而MTT法生長曲線不明顯，可能是時間段間隔較短或者細胞數(shù)量較少的原因。
　　3.體內(nèi)鼠BMSCs對C6膠質(zhì)瘤的治療作用
　　目的：建立C6膠質(zhì)瘤模型，通過在體實驗探討B(tài)MSCs在體內(nèi)環(huán)境下對C6膠質(zhì)瘤趨向性及生長的抑制及其對荷瘤大鼠的機體功能和生存周期的影響,觀察其治療效

8、果。方法：體外培養(yǎng)大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞，立定定向接種1.0×106個/10μC6膠質(zhì)瘤細胞于SD大鼠右側(cè)尾狀核，建C6膠質(zhì)瘤的SD大鼠荷瘤模型；1周后向左側(cè)側(cè)腦室注射BrdU標記的BMSCs；觀察2個月，記錄大鼠機體功能變化和生存情況，SD大鼠生存周期繪成Kaplan-Meier圖，組間差異行Log-rankTest(時序檢驗)；大鼠自然死亡后行HE染色和BrdU免疫組化染色，檢測膠質(zhì)瘤的情況和BMSCs對膠質(zhì)瘤的趨向性。結(jié)果：接種一周后

9、，各組大鼠精神差，活動減少，飲食減少，體重漸減，自然死亡前肢體不自主抽動，實驗組各大鼠各種機體功能減退及體重減輕較對照組輕，飲食量相對大；各組成瘤率為100％；對照組各鼠在60天內(nèi)均死亡，中位生存期為20.05±1.087d；治療組中位生存期為31.55±3.092d，其中有2只長期存活>60d，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),但在早期實驗組較對照組生存周期延長并不明顯。HE染色結(jié)果示實驗組C6膠質(zhì)瘤瘤體較對照組小，而且腫瘤邊緣向周圍腦