利用優(yōu)化后的桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方法構(gòu)建人乳頭瘤病毒假病毒體外感染模型.pdf

1、HPV感染是常見的性傳播疾病，與宮頸癌及泌尿生殖道相關(guān)癌癥的發(fā)生關(guān)系密切，嚴(yán)重危害人類健康。開發(fā)安全有效的HPV預(yù)防疫苗有望消滅或顯著降低。HPV感染造成的危害，具有十分重大的社會意義。我實驗室正在研究開發(fā)HPV基因工程疫苗，迫切需要可簡便有效對候選疫苗的保護性進(jìn)行評估的方法。目前的HPV體外感染模型在實驗周期、穩(wěn)定性、滴度等方面存在各自的缺點，而新型實驗技術(shù)平臺的發(fā)展為構(gòu)建更有效的感染模型提供了有利條件。桿狀病毒近幾年來被發(fā)現(xiàn)可作為一

2、種對哺乳動物細(xì)胞的新型基因轉(zhuǎn)移載體，相比其它基因轉(zhuǎn)移方法具有許多獨特的優(yōu)勢。本論文即探討了應(yīng)用重組桿狀病毒在哺乳動物細(xì)胞中構(gòu)建HPV假病毒的可行性。為了更有效的獲得HPV假病毒本論文對重組桿狀病毒對哺乳動物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移方法進(jìn)行了研究，建立了更為簡便、快捷且高效的基因轉(zhuǎn)移方法。該方法被成功用于建立了有效的HPV16假病毒體外感染模型，以及鑒定桿狀病毒滴度的新方法。 本研究利用Bac-to-Bac系統(tǒng)、增強型綠色熒光蛋白EGFP和

3、CMV-T7聯(lián)合啟動子構(gòu)建對哺乳動物細(xì)胞的桿狀病毒基因轉(zhuǎn)移載體，首先探討了直接使用重組桿狀病毒感染后的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)上清對哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的可行性。將重組桿狀病毒感染4d后的Sf-9細(xì)胞培養(yǎng)上清(≥1.0×107PFU/mL)直接與HepG2細(xì)胞37℃作用12h，可獲得高于95％的基因轉(zhuǎn)移效率，證明了重組桿狀病毒感染后的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)上清可直接用于高效轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞。通過對轉(zhuǎn)導(dǎo)時間和稀釋比例的優(yōu)化，顯示用哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基等體積稀

4、釋后的帶毒上清可兼具高效和低損傷的特點。應(yīng)用上述結(jié)果本研究首次提出并初步建立了重組桿狀病毒上清轉(zhuǎn)導(dǎo)法。該方法與脂質(zhì)體、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、重組痘苗病毒進(jìn)行的對比顯示其具有高效、低毒的優(yōu)點。應(yīng)用該方法對27種不同類型及組織來源的哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移實驗，包括16種人類組織細(xì)胞、9種嚙齒類組織細(xì)胞和2種猴組織細(xì)胞，結(jié)果顯示該方法具有較好的適用性，可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞。并發(fā)現(xiàn)重組桿狀病毒對靈長類來源細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移效率顯著高于對嚙齒類來

5、源細(xì)胞，對貼壁細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移效率顯著高于對懸浮細(xì)胞。 結(jié)合最新的研究進(jìn)展，本研究進(jìn)一步對病毒上清轉(zhuǎn)導(dǎo)法的實驗條件進(jìn)行摸索優(yōu)化，并嘗試采用新方法提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。對使用不同的稀釋緩沖液和轉(zhuǎn)導(dǎo)溫度的研究結(jié)果顯示，以PBS作為稀釋緩沖液在27℃下進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)可顯著提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。在PBS環(huán)境中對比不同轉(zhuǎn)導(dǎo)時間和稀釋比例以及不同血清含量對轉(zhuǎn)導(dǎo)效果的影響結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與轉(zhuǎn)導(dǎo)時間和病毒用量均呈正相關(guān)，并首次發(fā)現(xiàn)PBS中存在血清成分不利于提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效

6、率。應(yīng)用不同濃度丁酸鈉增強表達(dá)的實驗結(jié)果顯示，0.5～1mM的丁酸鈉較為合適于在CV1細(xì)胞中提高桿狀病毒載體的表達(dá)效率，更高濃度的丁酸鈉對細(xì)胞有明顯毒性。本研究首次在桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞中使用離心方法，結(jié)果顯示通過600g水平離心1h即可獲得高水平的轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)效率，優(yōu)于在PBS環(huán)境中27℃孵育8h的效果，并進(jìn)一步對離心時間、離心后孵育時間、緩沖液進(jìn)行了摸索優(yōu)化。應(yīng)用上述結(jié)果本研究首次提出并建立了重組桿狀病毒上清離心轉(zhuǎn)導(dǎo)法。病毒上清以

7、PBS為緩沖環(huán)境600g水平離心1h進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法可在獲得高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的同時顯著縮短實驗時間，提高了實驗效率。該方法具有簡便、快捷和高效的特點，并可作為一種常規(guī)操作方法用于日常實驗。本研究同時探討了輔助感染可表達(dá)T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒VV-T7RP對表達(dá)的影響，顯示輔助感染VV-T7RP可顯著增強帶有CMV-T7聯(lián)合啟動子的重組桿狀病毒的表達(dá)效果，表明將重組痘苗病毒VV-T7RP與重組桿狀病毒結(jié)合可建立一種高效瞬時表達(dá)方法。

8、 本研究首次設(shè)計構(gòu)建了可同時在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)HPV16L1和L2蛋白的重組桿狀病毒，并采用本研究建立的重組桿狀病毒上清離心轉(zhuǎn)導(dǎo)法，探討了通過重組桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方法在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)組裝HPV16假病毒的可行性。細(xì)胞感染實驗和透射電鏡觀察結(jié)果證實，通過該方法成功獲得了具有感染能力的HPV16假病毒。應(yīng)用已被證實的4株HPV16單抗，證明該假病毒感染模型可應(yīng)用于進(jìn)行中和實驗。應(yīng)用該模型，從本實驗室構(gòu)建的18株HPV16單抗中篩選獲得

9、2株中和單抗3D10和PD1，同時證明本實驗室構(gòu)建的候選基因工程疫苗HPV16 VLP可激發(fā)Balb/c小鼠產(chǎn)生具有中和能力的保護性體液免疫。該模型的成功建立為HPVl6中和抗體的篩選和HPV16預(yù)防疫苗的研究提供了必要的條件和有力的支持，也為進(jìn)一步構(gòu)建其它型別的HPV假病毒體外感染模型提供了基礎(chǔ)。本研究還首次嘗試了使用HPV16假病毒對昆蟲細(xì)胞的感染實驗，顯示HPV16假病毒可能具有將核酸導(dǎo)入昆蟲細(xì)胞的能力。 大量的關(guān)于重組桿

10、狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用研究實踐顯示，準(zhǔn)確測定病毒滴度對于保持蛋白生產(chǎn)和研究實驗的穩(wěn)定性是十分重要的。本研究綜合了應(yīng)用重組桿狀病毒上清離心轉(zhuǎn)導(dǎo)法可高效轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞的特點以及輔助感染VV-T7RP可顯著增強CMV-T7聯(lián)合啟動子表達(dá)水平的特點，提出了新型的可在哺乳動物細(xì)胞中測定重組桿狀病毒滴度的方法。本研究設(shè)計構(gòu)建了同時具有在昆蟲細(xì)胞中和哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)報告基因的重組桿狀病毒。應(yīng)用該病毒首先在昆蟲細(xì)胞中準(zhǔn)確測定滴度，再通過梯度稀釋后

11、離心轉(zhuǎn)導(dǎo)CV1細(xì)胞并輔助感染VV-T7RP，在12～24h后直接觀察細(xì)胞發(fā)光情況，以TCID50方法計算病毒滴度。結(jié)果顯示，以CMV-T7聯(lián)合啟動子引導(dǎo)的EGFP報告基因表達(dá)元件在VV-T7RP輔助下具有最高的檢測靈敏度，其測得的滴度與昆蟲細(xì)胞中測得的滴度相當(dāng)，優(yōu)于單獨使用CMV啟動子或T7啟動子。本研究首次提出了可將CMV-T7-EGFP表達(dá)元件作為一種優(yōu)良的病毒滴度鑒定元件克隆于桿狀病毒載體上，其在昆蟲細(xì)胞中不會進(jìn)行有效表達(dá)和干擾重