重組桿狀病毒高效篩選方法的建立.pdf

1、桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(BEVS)目前已發(fā)展成為一種高效率的真核細(xì)胞表達(dá)載體系統(tǒng)，其在研究基因表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能分析、生物活性物質(zhì)的制備及基因治療等方面發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。但是在構(gòu)建BEV的過(guò)程中，重組病毒的空斑篩選操作技術(shù)性強(qiáng)，效率低，成為了制約BEVS發(fā)展的瓶頸步驟。本文針對(duì)這一問(wèn)題，提出了一種篩選重組病毒的新方法：利用桿狀病毒gp64表面展示系統(tǒng)，在重組病毒表面展示標(biāo)簽蛋白，通過(guò)親和層析的方法，篩選出重組病毒。

2、本實(shí)驗(yàn)采用基因工程技術(shù)構(gòu)建了轉(zhuǎn)移載體gst-gp64-rfp-pFastBacl，利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)，構(gòu)建重組桿粒gst-gp64-rfp-Bacmid。同時(shí)構(gòu)建了兩個(gè)對(duì)照重組桿粒：gp64-rfp-Bacmid，gst-rfp-Bacmid。重組桿粒轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞48h后，在熒光顯微鏡下(最大發(fā)射波長(zhǎng)583nm，最大吸收波長(zhǎng)為558nm)可觀察到紅色熒光。說(shuō)明外源基因rfp在sf9細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。利用RT-PCR

3、對(duì)外源基因gst-gp64、gp64及gst在sf9細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增出目的片段。證明rfp、gp64、gst及gst-gp64融合基因在sf9細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。三種重組病毒液分別通過(guò)GlutathioneSepharose4Bmedium，收集流出液和洗脫液并分別感染sf9細(xì)胞。兩個(gè)對(duì)照重組病毒液經(jīng)過(guò)親和層析后的流出液重感染sf9細(xì)胞，在熒光顯微鏡下可以觀察到細(xì)胞內(nèi)有紅色熒光，而洗脫液重感染的sf9細(xì)胞沒(méi)有觀察到熒光。說(shuō)明只

4、表達(dá)了GST蛋白或gp64蛋白的重組病毒沒(méi)有吸附到GST親和介質(zhì)上，無(wú)法通過(guò)GST親和層析篩選。gst-gp64-rfp-Bacmid的病毒液通過(guò)GST親和層析介質(zhì)后，流出液重感染的sf9細(xì)胞沒(méi)有觀察到熒光，而洗脫液重感染后觀察到sf9細(xì)胞有紅色熒光。說(shuō)明表達(dá)了GST-gp64融合蛋白的重組病毒，由于在病毒表面展示了GST標(biāo)簽蛋白，可以被吸附到親和層析介質(zhì)上并通過(guò)洗脫收集。因此，在構(gòu)建BEV時(shí)，將gst-gp64融合基因與感興趣的目的基