人乳頭瘤病毒16型L1-E7CTL重組桿狀病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞.pdf

1、人乳頭瘤病毒(HPV)是人類多種疾病的致病原，能夠引起包括宮頸上皮在內(nèi)的多種皮膚粘膜上皮的增殖，如宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變、皮膚生殖器疣狀增生和喉乳頭狀瘤病等。皮膚粘膜局部發(fā)生的HPV感染還會(huì)促進(jìn)人類免疫缺陷病毒(HIV)的傳播，因?yàn)榫植康难装Y會(huì)使皮膚產(chǎn)生細(xì)小的損傷，并且有淋巴細(xì)胞和吞噬細(xì)胞浸潤(rùn)，這都有利于HIV進(jìn)入機(jī)體并感染靶細(xì)胞。由HPV持續(xù)感染引起的宮頸癌是死亡率極高的婦女惡性腫瘤，對(duì)患者的生理和心理造成了極大的傷害，嚴(yán)重危害了

2、人類健康。雖然早期發(fā)現(xiàn)，早期手術(shù)并結(jié)合化療和放療治療宮頸癌能有效緩解病情，提高患者的五年生存率，但是卻使患者的生活質(zhì)量大大降低，并且不能最終清除被病毒感染的細(xì)胞，防止腫瘤復(fù)發(fā)。研究證實(shí)具有致癌性的人乳頭瘤病毒的持續(xù)感染是宮頸癌主要病因，95％以上的病例可以由HPV16，18，31，33，45和56型的感染來(lái)解釋，而HPV16則是癌組織內(nèi)最常見(jiàn)的一種，檢出率超過(guò)50％，因此研制一種有效針對(duì)HPV16的疫苗成為防治由HPV16持續(xù)感染導(dǎo)致的

3、宮頸癌的最佳途徑。大量的理論和實(shí)驗(yàn)資料表明，由晚期基因編碼的L1衣殼結(jié)構(gòu)蛋白的C末端數(shù)十個(gè)氨基酸殘基對(duì)病毒的自組裝是非必須的，去除該區(qū)域后連接上60余個(gè)外源氨基酸殘基仍能自行組裝成病毒樣顆粒(VLPs)。自我組裝形成的VLPs在形態(tài)上與真正的病毒顆粒沒(méi)有差別，并且空間構(gòu)象相似，但不包含病毒性癌基因組，因此可誘導(dǎo)產(chǎn)生有利的體液免疫反應(yīng)卻沒(méi)有潛在的致癌危險(xiǎn)性，以此達(dá)到預(yù)防感染的目的。另一方面，為了有效的清除已經(jīng)感染病毒的細(xì)胞，阻止其無(wú)限增殖

4、，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫作用同樣重要。作為細(xì)胞免疫反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)在病毒感染時(shí)通過(guò)兩種機(jī)制：細(xì)胞裂解和細(xì)胞凋亡殺傷被感染的細(xì)胞，進(jìn)而在清除病毒和阻止感染慢性化中起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，慢性HPV感染者外周血或局部組織中存在特異性CTL，這些CTL可以識(shí)別HPV編碼蛋白中一個(gè)或多個(gè)表位?；蛑亟M或人工合成的HPV蛋白多肽，可在體外刺激CTL，增強(qiáng)其溶解HPV感染的靶細(xì)胞。更重要的是，CTL可識(shí)別細(xì)胞內(nèi)表達(dá)

5、的HPV抗原，并對(duì)這些表達(dá)抗原的細(xì)胞有溶解作用。因此，CTL在清除HPV感染中起重要作用。刺激產(chǎn)生CTL的方法很多，其中最常用的是誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞(APC)表達(dá)病毒抗原并與主要組織相容性復(fù)合物一同刺激CTLs。大部分HPV相關(guān)的腫瘤僅表達(dá)E6和E7，因此治療性疫苗的大部分工作都直接針對(duì)E6和E7抗原。但是以往的很多研究都是針對(duì)E7或E6的全基因片段進(jìn)行的，但這必然會(huì)造成一些變異或可溶性的抗原多肽與CTL的表面受體結(jié)合，阻止CTL與被感染

6、的HPV靶細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，或者與表位競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合靶細(xì)胞表面的MHCⅠ類分子，使CTL不能最大程度地發(fā)揮殺傷功能。因此，如何解決這一問(wèn)題，成為研制更加有效的治療性疫苗的關(guān)鍵。 本實(shí)驗(yàn)對(duì)如何產(chǎn)生更加有效的預(yù)防和治療性疫苗進(jìn)行了探索性的研究。首先在以往研究的基礎(chǔ)上，利用L1蛋白在C端缺失數(shù)十個(gè)氨基酸仍可自行組裝這一特性，選取其M1-Q471的基因片段為目的基因一。目的基因的模板來(lái)源于HPV16標(biāo)準(zhǔn)病毒株pHPV16，采用分段PCR的方法擴(kuò)增

7、出L1序列的兩部分L1a和L1b，分別以限制性內(nèi)切酶SalⅠ，BamH和XbaⅠ，BamHⅠ雙酶切后逐一插入克隆載體pUC19中，構(gòu)建出包含L1的克隆質(zhì)粒pHPV16L1。同時(shí)選取能最為有效激活特異性CTL反應(yīng)的單一表位E749-57的基因片段為目的基因二，并將其連接到片段一的下游區(qū)域，構(gòu)建融合基因。E749-57的氨基酸序列為RAHYNIVTF，通過(guò)人工合成相應(yīng)的編碼核苷酸序列，并引入合適的酶切位點(diǎn)和翻譯終止信號(hào)。將目的基因二與克隆載

8、體pUC19連接后通過(guò)藍(lán)白斑篩選和測(cè)序鑒定確定陽(yáng)性重組克隆pUC19E7CTL。再將用SalⅠ和XbaⅠ雙酶切獲得的L1序列克隆入pUC19E7CTL中，獲得包含融合基因的重組質(zhì)粒pHPV16L1/E7CTL，并通過(guò)酶切鑒定和測(cè)序確定融合基因的核酸序列與GENEBANK中的標(biāo)準(zhǔn)序列相比準(zhǔn)確無(wú)誤。其次，本實(shí)驗(yàn)選用了利用轉(zhuǎn)座原理構(gòu)建的Bacmid-桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)，這一系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)便，費(fèi)用低廉以及表達(dá)準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。用SalⅠ和

9、KpnⅠ雙酶切后將上一步驟所得的融合基因L1/E7CTL再一次通過(guò)亞克隆的方法插入轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)粒pFastBacl中，獲得重組pFastBaclHPV16L1/E7CTL。該轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)粒含有轉(zhuǎn)座子Tn7，將目的片段轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH10Bac后，能夠在DH10Bac內(nèi)所含的幫助質(zhì)粒提供的轉(zhuǎn)座酶的作用下，定點(diǎn)轉(zhuǎn)座至線性穿梭質(zhì)粒Bacmid上miniattTn7位點(diǎn).轉(zhuǎn)化后的DH10Bac在涂布含慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、Bluo-gal和IPTG的

10、LB平板上培養(yǎng)，通過(guò)藍(lán)白斑篩選出包含重組桿粒的陽(yáng)性克隆，獲得重組桿粒BACMIDDNA，并以通用引物M13PCR鑒定插入片段的大小。繼而將純化的重組桿粒與轉(zhuǎn)染因子Cellfectin混勻，在超凈臺(tái)中轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞。72小時(shí)后觀察細(xì)胞形態(tài)，部分細(xì)胞出現(xiàn)了典型的感染征象，表明獲得的重組桿粒能夠轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞。為下一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)，研究重組蛋白的免疫活性，生物學(xué)活性和空間構(gòu)象提供了有利條件，為下一步用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究此重組蛋白的作用打