特異性下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP94對(duì)人大腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性影響的研究.pdf

1、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文特異性下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP94對(duì)人大腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性影響的研究姓名：陳瑤申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：細(xì)胞生物學(xué)指導(dǎo)教師：宋今丹2003.3.1功能，還有助于理解UPR通路的變化?；诖?，我們選擇了人大腸癌細(xì)胞株CCL229作為研究對(duì)象，通過特異性核酶打靶的方式，下調(diào)細(xì)胞中GRP94的表達(dá)水平，觀察其對(duì)人大腸癌細(xì)胞某些生物學(xué)特性及UPR通路的影響，加深對(duì)GRP94、UPR和腫瘤這三者間關(guān)系的了解。方法1穩(wěn)定下調(diào)G

2、RP94的人大腸癌細(xì)胞克隆株的構(gòu)建(1)分別對(duì)含有特異性打靶GRP94核酶的質(zhì)粒pRe／RSV—ribol和對(duì)照組質(zhì)粒pRe／RSV進(jìn)行小量提取、PvulI酶切鑒定?！?2)測(cè)定pRc／RSV—ribol和pRe／RSV的基因序列，以質(zhì)粒DNA大量提純方法獲得純化的質(zhì)粒。(3)按照Fugene。”6transfectionreagent說明書分別用兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人大腸癌細(xì)胞CCL229。(4)分別通過RT—PER方法和Westernblo

3、t方法從mRNA和蛋白水平檢測(cè)GRP94的表達(dá)情況，以此鑒定轉(zhuǎn)染成功的陽性克隆株。2檢測(cè)GRP94表達(dá)水平下降對(duì)人大腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響(1)光鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)、貼壁狀態(tài)、聚集生長(zhǎng)能力和生長(zhǎng)速度。(2)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間。(3)檢測(cè)細(xì)胞聚集能力，計(jì)算細(xì)胞的聚集度。(4)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。3檢測(cè)GRP94表達(dá)水平下降對(duì)相關(guān)分子伴侶GRP78和PDI的影響(1)分別通過RT—PER方法和Westernbl