CD133陽(yáng)性造血祖細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、研究背景和目的： 結(jié)直腸癌(colorectalcarcinoma，CRC)是我國(guó)常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，而轉(zhuǎn)移是患者的主要致死原因。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多階段的復(fù)雜過(guò)程，轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷了細(xì)胞骨架變化、黏附特性的改變、運(yùn)動(dòng)能力的增強(qiáng)及蛋白水解酶表達(dá)增加等一系列改變。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)最新的研究表明，造血祖細(xì)胞與腫瘤轉(zhuǎn)移有著密切聯(lián)系，KaplanRN等利用β半乳糖苷酶標(biāo)記骨髓細(xì)胞移植的小鼠Lewis肺癌模型、小鼠B16黑

2、色素瘤模型和c-myc轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)性淋巴瘤模型發(fā)現(xiàn)：VEGFR-1陽(yáng)性造血祖細(xì)胞(vascularendothelialgrowthfactorreceptor-1hemopoieticprogenitorcells，VEGFR-1+HPC)首先在特定器官形成VEGFR-1+HPC細(xì)胞簇(VEGFR-1+HPCcellularclusters)，為瘤細(xì)胞準(zhǔn)備了易于形成轉(zhuǎn)移的微環(huán)境，這些細(xì)胞簇形成部位與腫瘤轉(zhuǎn)移常見(jiàn)部位一致。研究表明，V

3、EGFR-1+HPC充當(dāng)了腫瘤轉(zhuǎn)移必不可少的細(xì)胞書(shū)簽(cellularbookmarking)或者說(shuō)特使細(xì)胞(envoycells)。VEGFR-1+HPC并非以前發(fā)現(xiàn)的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcells，EPC)即VEGFR-2陽(yáng)性造血祖細(xì)胞，腹腔注射VEGFR-2抗體，不能阻斷VEGFR-1+HPC細(xì)胞簇形成及瘤轉(zhuǎn)移灶形成，只能限制腫瘤轉(zhuǎn)移灶生長(zhǎng)。同時(shí)利用VEGFR-1抗體阻斷或剔除VEGFR-1+

4、HPC，則能夠抑制預(yù)遷移器官造血祖細(xì)胞簇的形成與腫瘤轉(zhuǎn)移。但造血祖細(xì)胞在人體腫瘤的主要作用及機(jī)制仍不十分清楚，且目前尚未在人類腫瘤模型上得到證實(shí)，由于臍血來(lái)源廣泛，獲取較容易，成為骨髓及外周造血干祖細(xì)胞的極佳替代來(lái)源，我們選定CD133+造血祖細(xì)胞，在減少其誘導(dǎo)分化的同時(shí)，觀察其對(duì)低轉(zhuǎn)移人大腸癌細(xì)胞體內(nèi)外的增殖和侵襲作用。 CD133是一個(gè)目前公認(rèn)的造血祖細(xì)胞表面抗原，在正常及異常造血和非造血組織中均有表達(dá)，隨著細(xì)胞的分化成熟其

5、表達(dá)減弱、消失。在正常造血組織中，如人胚胎、肝臟和骨髓、臍血、成人骨髓和外周血CD34+細(xì)胞中都可檢測(cè)到CD133mRNA，而在其他成熟血細(xì)胞均未檢測(cè)到其表達(dá)。同時(shí)隨著最新的研究表明，CD133mRNA在外周血中的表達(dá)里，實(shí)體惡性腫瘤轉(zhuǎn)移患者的表達(dá)水平明顯高于非轉(zhuǎn)移患者，且以骨轉(zhuǎn)移患者的CD133mRNA表達(dá)為著。但這一結(jié)果的作用機(jī)制主要是由于CD133+造血祖細(xì)胞或者是CD133+腫瘤干細(xì)胞的結(jié)果尚不清楚。 本研究重點(diǎn)探討CD

6、133+造血祖細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響，闡明CD133+造血祖細(xì)胞在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的主要生物學(xué)功能，為揭示結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移機(jī)制及抗轉(zhuǎn)移治療奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.CD133+造血祖細(xì)胞的篩選、鑒定及培養(yǎng) 由南方醫(yī)院婦產(chǎn)科提供新鮮臍血標(biāo)本20例，在臍血采集后6h內(nèi)，利用CD133+免疫磁珠，分離出CD133+造血祖細(xì)胞，并分別予流式細(xì)胞儀及免疫細(xì)胞染色分析和鑒定樣本量中CD133+細(xì)胞含量，同時(shí)在減少誘導(dǎo)C

7、D133+分化的同時(shí)，培養(yǎng)CD133+造血祖細(xì)胞。 2.CD133+造血祖細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 將CD133+造血祖細(xì)胞與SW480共趨化培養(yǎng)，用MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖及黏附能力的影響，用Transwell小室法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的遷移能力的變化，用Westernblot了解VEGFR-1、MMP-2、E-Cadherin的表達(dá)情況。觀察CD133+造血祖細(xì)胞作用前后細(xì)胞增殖、體外侵襲變化。 3.應(yīng)用

8、整體可視化結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型觀察共移植效應(yīng) 利用穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)的結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480/EGFP+；通過(guò)結(jié)腸癌尾靜脈注射的方法建立結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移模型，利用腫瘤細(xì)胞表達(dá)EGFP的特點(diǎn)，將CD133+細(xì)胞與SW480/EGFP+共培養(yǎng)通過(guò)尾靜脈注射的方法觀察腫瘤細(xì)胞成瘤能力及體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的變化，應(yīng)用組織病理學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)價(jià)和鑒

9、定。 結(jié)果： 1、CD133+造血祖細(xì)胞的篩選、鑒定及培養(yǎng) 由南方醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，臍血標(biāo)本共20份(其中18份成功提取新鮮細(xì)胞，2份失敗)，50～80ml/份，枸櫞酸抗凝，經(jīng)產(chǎn)婦和家屬同意取自足月健康順產(chǎn)新生兒，新鮮臍血采集后6h內(nèi)，分離出CD133+造血祖細(xì)胞。從新鮮的臍血中得到的單個(gè)核細(xì)胞數(shù)平均為(1.48±0.19)×107/ml，經(jīng)CD133磁珠分離系統(tǒng)分離得CD133+富集細(xì)胞的平均數(shù)為(1.33±0.

10、01)×105/ml，新鮮臍血單個(gè)核細(xì)胞中的CD133+細(xì)胞所占比例為(0.8±0.01)％，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定CD133+CD34+細(xì)胞純度達(dá)到80％以上。CD133+細(xì)胞培養(yǎng)一周后，免疫細(xì)胞化學(xué)染色CD133，顯微鏡下觀察CD133陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>90％。 2、CD133+造血祖細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 CD133+造血祖細(xì)胞能顯著促進(jìn)SW480細(xì)胞的生長(zhǎng)(n=60、Z=-6.106、P=0.000)，能促進(jìn)腫瘤

11、細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，即腫瘤細(xì)胞的核深染，異型明顯，細(xì)胞呈多角形或不規(guī)則形，能顯著促進(jìn)SW480細(xì)胞的遷移能力；細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)表明，含有CD133+造血祖細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組其腫瘤細(xì)胞的黏附能力明顯高于對(duì)照組(n=60、Z=-3.679，P=0.000)。利用丙酮沉淀法提取細(xì)胞總蛋白(即濃縮蛋白)檢測(cè)MMP-2、VEGFR-1及E-Cadherin蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中的3種蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組。 3、利用整體可視化結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移裸鼠模型觀

12、察共移植效應(yīng) 轉(zhuǎn)染后的結(jié)腸癌細(xì)胞SW480/EGFP+穩(wěn)定、高效的表達(dá)綠色熒光蛋白，采用尾靜脈注射的方法建立結(jié)腸癌可視化轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，注射2周后，實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移，對(duì)照組未見(jiàn)有轉(zhuǎn)移情況，注射4周后，實(shí)驗(yàn)組67％發(fā)生轉(zhuǎn)移，對(duì)照組僅有一只發(fā)生轉(zhuǎn)移，注射6周后，實(shí)驗(yàn)組中成瘤轉(zhuǎn)移率為4/6，對(duì)照組中的成瘤轉(zhuǎn)移率為1/6。經(jīng)過(guò)生存分析的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組的轉(zhuǎn)移率高于對(duì)照組(n=6，Breslow檢驗(yàn)，P=0.045)。通過(guò)分子生物學(xué)技

13、術(shù)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中MMP-2、VEGFR-1蛋白高表達(dá)，而E-Cadherin的表達(dá)則逐漸減低。 結(jié)論： 1、CD133+造血祖細(xì)胞可顯著促進(jìn)人結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力，CD133+造血祖細(xì)胞與人結(jié)直腸癌細(xì)胞裸鼠共移植具有促轉(zhuǎn)移作用，初步證明，人造血祖細(xì)胞可能對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移形成具有重要影響。 2、CD133+造血祖細(xì)胞可與結(jié)直腸癌細(xì)胞直接作用，能促進(jìn)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和血管生成因子MMP-2、VEGFR-1蛋白

14、高表達(dá)，同時(shí)調(diào)節(jié)E-Cadherin的蛋白表達(dá)，初步表明：CD133+造血祖細(xì)胞的促轉(zhuǎn)移作用可能與轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP-2、VEGFR-1及E-Cadherin的表達(dá)有關(guān)。 本研究的創(chuàng)新之處： 1、將人造血祖細(xì)胞與結(jié)直腸癌細(xì)胞株共趨化培養(yǎng)，直接在人癌實(shí)驗(yàn)層次揭示了造血祖細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的作用。 2、將人造血祖細(xì)胞與結(jié)直腸癌細(xì)胞株共趨化培養(yǎng)后進(jìn)行人類腫瘤動(dòng)物模型共移植實(shí)驗(yàn)研究。初步證明，CD133+人造血祖細(xì)胞可顯