特異性DcR3-siRNA對肝細胞癌生物學(xué)特性影響的研究.pdf

1、目的：肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率有逐步上升的趨勢，嚴重危害人民的健康。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)和相應(yīng)的腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)結(jié)合，轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號進入靶細胞，使靶細胞發(fā)生凋亡，是機體免疫系統(tǒng)清除腫瘤細胞的常見方式，而腫瘤細胞表達死亡因子的誘捕受體是腫瘤逃避

2、機體免疫殺傷的機制之一。近年來新發(fā)現(xiàn)的TNFR超家族成員DcR3通過影響FasL、LIGHT和TLlA的促凋亡作用和免疫調(diào)節(jié)作用而抑制機體的抗腫瘤免疫，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。研究表明HCC組織存在DcR3的過表達，影響}tCC細胞的凋亡，且HCC患者DcR3的表達水平與腫瘤的TNM分期、浸潤或轉(zhuǎn)移有關(guān)。這些研究結(jié)果提示，若能抑制DcR3的表達則有助于阻抑腫瘤的發(fā)展與浸潤轉(zhuǎn)移。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由

3、與靶基因序列同源的雙鏈RNA(dotlble—stranded RNA，dsRNA)啟動的一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制，其介導(dǎo)子是21—25nt的小干擾RNA(short interfering RNA，siRNA)，由細胞內(nèi)的dsRNA特異性核酸內(nèi)切酶(dsRNA specific eradonuclease，Dicer)酶切產(chǎn)生。由于siRNA具有特異性高、抑制作用強、穩(wěn)定性高、細胞攝取相對容易等優(yōu)點，因此，RNAi技術(shù)目前已

4、經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因功能研究和基因治療方面。本研究擬通過RNA干擾技術(shù)抑制HCC細胞系HepG2中DcR3的表達，檢測DcR3干擾后Hep62細胞增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)特性的改變，從而探討DcR3在HCC發(fā)生發(fā)展與浸潤轉(zhuǎn)移中的作用。 材料與方法： 1.應(yīng)用RT—PCR方法檢測人HCC細胞系HepG2、癌旁肝細胞系QSG-7701及正常肝細胞系HL-7702中DcR3的表達情況。 2.設(shè)計并合成針對DcR3基因的特

5、異性siRNA，采用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000將siRNA轉(zhuǎn)染至高表達DcR3的HCC細胞系HepG2，通過熒光顯微鏡下觀察和應(yīng)用流式細胞儀鑒定和檢測轉(zhuǎn)染效率。 3.應(yīng)用半定量RT—PCR方法篩選有效的靶序列，將篩選出的有效靶序列轉(zhuǎn)染HepG2細胞，免疫細胞化學(xué)法檢測其對HepG2細胞DcR3蛋白表達的影響。 4.應(yīng)用MTT法檢測細胞增殖能力的改變。 5.應(yīng)用流式細胞儀測細胞周期的

6、變化。 6.應(yīng)用流式細胞儀、DNA ladder方法檢測細胞的凋亡情況。 7.通過劃痕實驗檢測細胞體外遷移能力的變化。 結(jié)果：1.人HCC細胞系HepG2細胞中DcR3 mRNA呈現(xiàn)高表達，而癌旁肝細胞系QSG-7701和正常肝細胞系HL-7702細胞中無DcR3 mRNA表達。 2.LipofectamineTM2000能有效地將siRNA轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率約為85％。 3.各特異性DcR3

7、-siRNA均有抑制DcR3 mRNA表達的作用，其中以siRNA4的作用更明顯，干擾作用達62.9％，siRNA1、siRNA2、siRNA3的干擾作用分別為60.7％、32.1％、23.O％：轉(zhuǎn)染siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4組的DcR3 mRNA表達與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組及非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組對DcR3 mRNA的表達無影響，與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

8、P>0.05)。選擇抑制作用最明顯的siRNA4轉(zhuǎn)染HepG2細胞作為特異性組進行后續(xù)實驗。免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示，空白對照組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組及非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組細胞DcR3蛋白呈陽性表達(++--+++)，特異性DcR3-siRNA4轉(zhuǎn)染組細胞蛋白呈陰性或弱陽性表達(--+)，特異性DcR3-siRNA4轉(zhuǎn)染組與前三組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 4.MTT實驗：轉(zhuǎn)染后24h、48h及96h特異性DcR3-siR

9、NA4轉(zhuǎn)染組細胞吸光度值明顯低于空白對照組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組及非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。特異性DcR3-siRNA4轉(zhuǎn)染組細胞的增殖抑制率在24h、48h及96h分別為20.71％、35.00％和34.04％。 5.流式細胞儀測細胞周期：特異性DcR3-siRNA4轉(zhuǎn)染組與空白對照組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組及非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組細胞相比，G1期細胞比例增多而G2/M期細胞比例減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<

10、0.01)。 6.流式細胞儀檢測細胞凋亡的結(jié)果顯示，特異性DcR3-siRNA4轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率為(22.97±2.10)％，明顯高于空白對照組(1.17±0.32)％、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組(1.44±0.43)％及非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組(1.22±O．40)％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。DNA ladder檢測結(jié)果顯示，特異性DcR3-siRNA4轉(zhuǎn)染組DNA ladder陽性率為83.3％，明顯高于空白對照組(0％)、脂

11、質(zhì)體轉(zhuǎn)染組(0％)及非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組(0％)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 7.特異性DcR3-siRNA4轉(zhuǎn)染組細胞相對遷移率在24h、48h及96h均低于空白對照組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組及非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，而空白對照組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組及非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組每兩組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論：特異性DcR3-siRNA能有效抑制肝癌細胞系Hep