線粒體通透性轉(zhuǎn)換調(diào)控對(duì)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的作用研究.pdf

1、本文研究目的：探討抑制MPT對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的影響。 實(shí)驗(yàn)材料： 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑：出生1-2 d的新生Sprague-Dawley(SD)純種大白鼠，雌雄不拘，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。環(huán)孢菌素A(CsA)購(gòu)自Fluka BioChemika公司。鼠單克隆抗Cyt c抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記標(biāo)記的的抗小鼠IgG購(gòu)自Cell signaling公司。Calcein-AM購(gòu)自美

2、國(guó)Sigma公司，線粒體/胞漿蛋白分離試劑盒C1260購(gòu)自．Applygen公司， MHCα/β抗體和Tn I抗體購(gòu)自福州邁新公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG和羅丹明標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自中山生物科技公司，Annexin V+FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物制品有限公司。 2、主要儀器： BD FIACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó))，Leica Tcs sp2激光共聚焦顯微鏡(德國(guó))，UV22101紫外

3、分光光度計(jì)(Shimadazu公司，日本)；垂直電泳儀(美國(guó)Bio-Band公司)；轉(zhuǎn)移槽(美國(guó)Bio-Band公司)；低溫離心機(jī)(日本HITACHI)；Image MasterVDS(美國(guó) Pharmacie Bioteeh)。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、心肌細(xì)胞培養(yǎng)取新生大鼠心室肌，用胰酶和膠原酶消化，將細(xì)胞重懸于含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液。為純化心肌細(xì)胞，采用差速貼壁分離法去除貼壁的非心肌細(xì)胞。 將細(xì)胞稀釋成

4、適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液，按5.0×105個(gè)/ml密度接種于用1％明膠鋪底的90 rain培養(yǎng)皿。在開(kāi)始的24～36 h加入100 mM溴脫氧尿苷抑制非心肌細(xì)胞增殖。 2、實(shí)驗(yàn)分組將原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞按孔隨機(jī)分為五組。Con組：正常對(duì)照組，不予缺氧／復(fù)氧，而與其他組同步換液，所換培養(yǎng)基為無(wú)血清高糖DMEM；A/R組：缺氧復(fù)氧組，心肌細(xì)胞缺氧3 h，復(fù)氧2 h；CsA1組：心肌細(xì)胞缺氧前10 min給予1μMCsA(MPT抑制劑)；CsA

5、2組：心肌細(xì)胞復(fù)氧前10 min給予1μM CsA)；CsA3組：心肌復(fù)氧后10 min給予1μM CsA。 3、觀察指標(biāo) 復(fù)氧2 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況、Westem bloRing測(cè)定心肌細(xì)胞線粒體色素C釋放。復(fù)氧50 min后，采用cold-loading/warm incubation方法染色線粒體，激光共聚焦顯微鏡成像，觀察mPTP的開(kāi)放情況。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(

6、x±s)表示，應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，多組間比較用單因素方差分析(ANOVA)，多樣本均數(shù)間兩兩比較用最小顯著差法(LSD)，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： CsA1、CsA2組的細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于A/R組(P<0.05)。CsA3組細(xì)胞凋亡指數(shù)與A/R組無(wú)明顯差異。CsA1、CsA2組胞漿Cyt c的含量明顯低于A/R組(P<0.05)，CsA3組與A/R組無(wú)明顯差異。CsA1、CsA2組線粒

7、體Cyt c的含量明顯高于A/R組(P<0.05)，CsA3組與A/R組無(wú)明顯差異。CsA1、CsA2組Calcein保留在線粒體內(nèi)，胞漿熒光強(qiáng)度較弱，提示MPT未開(kāi)放。A/R、CsA3組Calcein從線粒體釋放到胞漿，胞漿熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，提示MPT開(kāi)放。 研究結(jié)論： 1、缺氧前和復(fù)氧前給予CsA可減少心肌細(xì)胞凋亡，保持Cyt c含量； 2、缺氧前和復(fù)氧前抑制MPT可以減輕心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷； 3、復(fù)