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1、本文研究目的:探討抑制MPT對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的影響。 實(shí)驗(yàn)材料: 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑:出生1-2 d的新生Sprague-Dawley(SD)純種大白鼠,雌雄不拘,由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。環(huán)孢菌素A(CsA)購(gòu)自Fluka BioChemika公司。鼠單克隆抗Cyt c抗體購(gòu)自Santa Cruz公司,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記標(biāo)記的的抗小鼠IgG購(gòu)自Cell signaling公司。Calcein-AM購(gòu)自美
2、國(guó)Sigma公司,線粒體/胞漿蛋白分離試劑盒C1260購(gòu)自.Applygen公司, MHCα/β抗體和Tn I抗體購(gòu)自福州邁新公司,F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG和羅丹明標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自中山生物科技公司,Annexin V+FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物制品有限公司。 2、主要儀器: BD FIACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)),Leica Tcs sp2激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)),UV22101紫外
3、分光光度計(jì)(Shimadazu公司,日本);垂直電泳儀(美國(guó)Bio-Band公司);轉(zhuǎn)移槽(美國(guó)Bio-Band公司);低溫離心機(jī)(日本HITACHI);Image MasterVDS(美國(guó) Pharmacie Bioteeh)。 實(shí)驗(yàn)方法: 1、心肌細(xì)胞培養(yǎng)取新生大鼠心室肌,用胰酶和膠原酶消化,將細(xì)胞重懸于含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液。為純化心肌細(xì)胞,采用差速貼壁分離法去除貼壁的非心肌細(xì)胞。 將細(xì)胞稀釋成
4、適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液,按5.0×105個(gè)/ml密度接種于用1%明膠鋪底的90 rain培養(yǎng)皿。在開(kāi)始的24~36 h加入100 mM溴脫氧尿苷抑制非心肌細(xì)胞增殖。 2、實(shí)驗(yàn)分組將原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞按孔隨機(jī)分為五組。Con組:正常對(duì)照組,不予缺氧/復(fù)氧,而與其他組同步換液,所換培養(yǎng)基為無(wú)血清高糖DMEM;A/R組:缺氧復(fù)氧組,心肌細(xì)胞缺氧3 h,復(fù)氧2 h;CsA1組:心肌細(xì)胞缺氧前10 min給予1μMCsA(MPT抑制劑);CsA
5、2組:心肌細(xì)胞復(fù)氧前10 min給予1μM CsA);CsA3組:心肌復(fù)氧后10 min給予1μM CsA。 3、觀察指標(biāo) 復(fù)氧2 h后,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況、Westem bloRing測(cè)定心肌細(xì)胞線粒體色素C釋放。復(fù)氧50 min后,采用cold-loading/warm incubation方法染色線粒體,激光共聚焦顯微鏡成像,觀察mPTP的開(kāi)放情況。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(
6、x±s)表示,應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,多組間比較用單因素方差分析(ANOVA),多樣本均數(shù)間兩兩比較用最小顯著差法(LSD),以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: CsA1、CsA2組的細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于A/R組(P<0.05)。CsA3組細(xì)胞凋亡指數(shù)與A/R組無(wú)明顯差異。CsA1、CsA2組胞漿Cyt c的含量明顯低于A/R組(P<0.05),CsA3組與A/R組無(wú)明顯差異。CsA1、CsA2組線粒
7、體Cyt c的含量明顯高于A/R組(P<0.05),CsA3組與A/R組無(wú)明顯差異。CsA1、CsA2組Calcein保留在線粒體內(nèi),胞漿熒光強(qiáng)度較弱,提示MPT未開(kāi)放。A/R、CsA3組Calcein從線粒體釋放到胞漿,胞漿熒光強(qiáng)度較強(qiáng),提示MPT開(kāi)放。 研究結(jié)論: 1、缺氧前和復(fù)氧前給予CsA可減少心肌細(xì)胞凋亡,保持Cyt c含量; 2、缺氧前和復(fù)氧前抑制MPT可以減輕心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷; 3、復(fù)
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