戊型肝炎病毒抗原肽的合成及ELISA檢測(cè)方法的建立和改良.pdf

1、戊型肝炎是一種經(jīng)糞一口途徑傳播的自限性病毒性肝炎,過(guò)去稱(chēng)腸道傳播的非甲非乙型肝炎.其病原體為戊型肝炎病毒.根據(jù)中國(guó)流行地區(qū)及季節(jié)性散發(fā)的病例獲得的中國(guó)株HEV序列研究表明與其它型別的HEV存在差異.中國(guó)不但有HEV Ⅰ型還有HEVⅣ型的流行和散發(fā).而目前ELISA所采用的重組蛋白或是合成抗原肽都只含有HEV Ⅰ型的序列,這很顯然存在不足.國(guó)內(nèi)另有學(xué)者報(bào)道了HEVⅣ型表位的存在及作用.我們綜合上述的研究結(jié)果,采用S42、NS33以及HEV

2、Ⅳ型ORF2的SP12序列(PSGRRRGQAG CG)作為我們待建立的ELISA實(shí)驗(yàn)方法的3段合成抗原肽.根據(jù)Merrifield的固相多肽合成方法(solid phase polypeptide synthesis SPPS),采用N-α-FMOC-氨基酸作為成份氨基酸,Wang樹(shù)脂為載體,以二異丙基碳二亞胺(DIC)作為縮合劑,加入復(fù)合添加劑1-羥基苯并三氮唑(HoBt),經(jīng)過(guò)脫保護(hù)→洗滌→縮合→洗滌,如此循環(huán)的合成路線,最后經(jīng)切

3、肽步驟獲得目標(biāo)抗原肽的合成過(guò)程.合成獲得的粗品肽再經(jīng)過(guò)離子交換層析和反相高效液相(RP-HPLC)純化得到純度>95％的合成抗原肽.收集血清抗-HEVIgG與或IgM為陽(yáng)性的和抗-HEVIgG與IgM為陰性的血清標(biāo)本(美國(guó)Genelab公司Kit測(cè)定)以及健康獻(xiàn)血員血清.應(yīng)用棋盤(pán)實(shí)驗(yàn)確定抗原最佳包被濃度、酶標(biāo)抗體稀釋度和標(biāo)本稀釋度.建立了合成抗原肽聯(lián)合包被檢測(cè)HEV抗體的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA).結(jié)果顯示,建立的ELISA方法批內(nèi)

4、CV為5.71％,批間CV為9.0％,穩(wěn)定性保持6個(gè)月,與美國(guó)Genelab試劑盒的符合率也良好IgG、IgM分別為95.6％和90.6％,并且實(shí)驗(yàn)證明在包被的合成多肽中加入SP12對(duì)于中國(guó)HEV流行現(xiàn)狀的檢測(cè)具有現(xiàn)實(shí)意義.但是和Genelab試劑盒進(jìn)行比較時(shí),也發(fā)現(xiàn)相同的陽(yáng)性標(biāo)本檢測(cè)吸光度值(OD)偏低(0.8~1.5),有顯著性差異(p<0.001).針對(duì)上述情況,我們采用Poly-l-ysine(PLL多聚賴(lài)氨酸)預(yù)先包板,然后再