國內(nèi)禽戊型肝炎病毒的分離鑒定及其抗原性的研究.pdf

1、禽戊型肝炎病毒（HEV）是雞的大肝大脾（BLS）病或肝炎脾大（HS）綜合癥的主要病原，主要引起30-72周齡的蛋雞和肉種雞的死淘率升高和產(chǎn)蛋率下降（20-40％），發(fā)病雞通常腹部充血，卵巢退化，肝臟脂肪或淀粉樣變性，偶有肝脾腫大。該病曾給澳大利亞的養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而我國也時有該病爆發(fā)的報道。
　　 禽HEV 與人、豬HEV 同屬于肝炎病毒屬，為無囊膜，單股正鏈RNA 病毒，其基因組全長約為6.6kb，比哺乳動物HEV

2、基因組全長少600bp左右，包含5'帽子和3' PolyA結(jié)構(gòu)，含有3個開放閱讀框（ORF），分別為ORF1、ORF2和ORF3。其中ORF2基因編碼衣殼蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，并且包含病毒主要的抗原表位。由于禽HEV 沒有合適有效的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，因此對該病毒的研究大多主要集中在病毒的亞單位蛋白ORF2上，通過原核或真核表達(dá)該蛋白，了解該蛋白的生物學(xué)活性和抗原性等，從而為該病毒的診斷和預(yù)防等提供材料和理論支持。
　　 1.國內(nèi)

3、禽HEV的RT-PCR 檢測。根據(jù)實驗室前期的禽HEV的血清學(xué)調(diào)查結(jié)果，從山東部分的禽HEV抗體陽性率較高的雞場，收集患有BLS病或HS綜合癥病雞的糞便、膽汁和血清。然后參考國外研究學(xué)者設(shè)計的禽HEV 檢測引物，對收集樣品中的禽HEV RNA 進(jìn)行RT-PCR 檢測。
　　 結(jié)果從山東某肉種雞場收集的糞便和膽汁樣品中檢測到禽HEV ORF2部分序列，通過該段序列與國外參考序列的同源性比較發(fā)現(xiàn)，與歐洲部分國家的分離株同源性較高。<

4、br>　　 2.國內(nèi)禽HEV分離株的全基因組序列分析。參考GenBank上已知禽HEV的全基因組序列，設(shè)計12對引物。利用RT-nest-PCR方法從禽HEV核酸檢測陽性的膽汁中，擴(kuò)增六段相互重疊的禽HEV的基因組片段，然后通過軟件拼接獲得首個國內(nèi)禽HEV分離株的全基因組序列，命名為CaHEV。將CaHEV 與已知參考的4個禽HEV 全基因組序列進(jìn)行同源性和進(jìn)化樹分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CaHEV與歐洲同源性最高，同屬于禽HEV基因3型。并且不

5、同禽HEV基因型的ORF2之間，氨基酸同源性達(dá)到97％以上，提示禽HEV可能僅存在單一的血清型。
　　 3.CaHEV的致病性研究。將含有禽HEV的膽汁翅靜脈攻毒1周齡的SPF 雞，對病毒進(jìn)行增殖，然后用GE方法對病毒懸液進(jìn)行定量。利用定量的CaHEV 病毒懸液，通過口腔和翅靜脈兩種途徑分別攻毒15周齡的SPF雞，每組26只。攻毒后每天收集糞樣，每三天收集血清，每周剖殺兩只雞，直到第12周剖殺所有雞只，收集剖殺雞只的膽汁，肝臟和

6、脾臟同時觀察剖殺雞只的肝臟和脾臟的肉眼損害以及其病理學(xué)變化。通過對收集樣品的RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，翅靜脈攻毒組，攻毒后第3天就能從糞便中檢測到病毒，一直持續(xù)到攻毒后54天仍能檢測到；第6天開始出現(xiàn)病毒血癥，約持續(xù)到第21天左右；口腔攻毒組，在攻毒后第6天開始糞便排毒，第62天仍然排毒，病毒血癥開始出現(xiàn)在第12天，持續(xù)到第33天。通過ELISA檢測攻毒雞的禽HEV抗體發(fā)現(xiàn)，翅靜脈攻毒組，抗體效價迅速達(dá)到高峰后就開始消退，而口腔接種組緩慢達(dá)

7、到高峰并維持一段時間。另外，兩種途徑接種均有只2 只雞出現(xiàn)了肝脾腫大和嚴(yán)重的出血壞死，臟器的病理學(xué)變化也都符合HS 綜合癥的部分臨床癥狀，實驗進(jìn)一步論證了禽HEV 可能是HS 綜合癥的主要病原，但并不是唯一原因。
　　 4.禽HEV抗體檢測的間接ELISA方法的建立及應(yīng)用。利用大腸桿菌原核表達(dá)禽HEV 衣殼蛋白C 端268個氨基酸，純化后獲得蛋白ORF2-268，將該蛋白作為包被抗原，摸索優(yōu)化ELISA條件，建立禽HEV血清學(xué)診

8、斷的間接ELISA方法。利用該ELISA方法，調(diào)查了山東省11個種雞場的禽HEV感染情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)11個種雞場都有過禽HEV的感染，不同雞場的血清陽性率差異顯著。其中有兩個雞場的陽性率達(dá)到了77％左右，而在檢測的所有1379 份血清中,493 份陽性，陽性率也達(dá)到了35.8％，說明禽HEV的感染在山東省某些種雞場已經(jīng)非常嚴(yán)重，而且該病的感染已在全省范圍內(nèi)廣泛流行。
　　 此外，利用該ELISA 方法，跟蹤檢測了某種雞場5個不同廠

9、區(qū)的不同周齡雞的禽HEV抗體的陽性率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5個廠區(qū)都在12周齡左右就檢測到了禽HEV抗體，在20-30周齡時，抗體陽性率達(dá)到最大，其中某個廠區(qū)在40-50周齡時出現(xiàn)了第二個高峰，大于60周齡時，抗體陽性率非常低。結(jié)果說明禽HEV在該種雞場自然狀況下的感染通常發(fā)生在小于10周齡的雞，當(dāng)雞只達(dá)到20-30周齡時，禽HEV感染了雞場里大多數(shù)的雞，當(dāng)達(dá)到60周齡時，禽HEV抗體已經(jīng)在大多數(shù)雞中消退。
　　 5.禽HEV人工感染雞后

10、產(chǎn)生的針對不同抗原區(qū)的抗體變化規(guī)律禽HEV的衣殼蛋白含有病毒主要的抗原表位，并且通過軟件分析和前期實驗室的研究發(fā)現(xiàn)，衣殼蛋白的前半段22-83aa 存在著一個主要的抗原區(qū)，而在后半段有339-383aa,389-410aa,461-492aa，556-566aa和583-600aa 5個主要的抗原區(qū)，另外ORF3蛋白上也存在著抗原表位能夠刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。為了研究這幾個抗原區(qū)在人工感染雞中產(chǎn)生的免疫應(yīng)答情況，利用實驗室前期表達(dá)的不同

11、的截段蛋白ORF2-F（包含22-83aa），ORF2-S（包含后半段5個主要的抗原區(qū)），ORF2-5（339-442aa，包含后半段前兩個抗原區(qū)），ORF2-8（383-515aa，包含后半段第2和第3個抗原區(qū)），ORF2-9（412-546aa，包含第4個抗原區(qū)）和ORF3蛋白作為包被抗原，間接ELISA 檢測了禽HEV 感染雞后不同日齡的血清中針對不同抗原區(qū)的抗體變化規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)針對ORF2-S蛋白的抗體在感染后12天左右就可以

12、檢測到，比ORF2-F和ORF3的早約3天左右，但是針對ORF2-F和ORF3的抗體效價迅速達(dá)到高峰后（感染后21天左右）就開始消退，而針對ORF2-S的則緩慢達(dá)到高峰維持一段時間后，緩慢消退。用ORF2-5 作為包被抗原檢測的抗體效價變化規(guī)律與用ORF2-S的相似，而用ORF2-8 作為包被抗原的則測得抗體效價很低，說明人工感染禽HEV的雞主要產(chǎn)生了針對抗原區(qū)339-383aa的抗原應(yīng)答反應(yīng)。當(dāng)用ORF2-9 作為包被抗原時，檢測不到

13、任何針對該蛋白的抗體，說明人工感染禽HEV的雞并沒有對該區(qū)域412-546aa產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。
　　 6.禽HEV病毒樣粒子的獲得利用桿狀病毒真核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)了禽HEV衣殼蛋白全長，N端缺失56個氨基酸的ORF2Δ56和C端268個氨基酸的ORF2-268蛋白。通過IFA和Western-blot鑒定發(fā)現(xiàn)，三段蛋白都在該系統(tǒng)中成功表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)ORF2Δ56蛋白表達(dá)后分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清中。同時將該系統(tǒng)表達(dá)的三段蛋白與原核表達(dá)