禽戊型肝炎病毒中國(guó)分離株ORF3蛋白抗原表位分析.pdf

1、2001年，Haqshenas等從患有肝脾腫大(Hepatitis-splenomegaly，HS)綜合癥的雞膽汁中首次分離和描述了禽HEV的全基因組序列。2010年，趙欽等首次分離并描述了國(guó)內(nèi)禽HEV的全基因組，序列分析發(fā)現(xiàn)與其它國(guó)家禽HEV的同源性為77.3％-95.5％。禽HEV感染主要引起30-70周齡的蛋雞和肉種雞的死淘率升高(1％)和產(chǎn)蛋率下降(20％-40％)，感染雞通常腹部紅腫，卵巢退化，偶有雞肝脾腫大、肝壞死和出血。血

2、清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病毒的感染在許多國(guó)家中已廣泛流行，而我國(guó)部分地區(qū)的雞群血清陽(yáng)性率也達(dá)到了30％左右。
　　 禽HEV屬于肝炎病毒屬，為單股正鏈RNA，基因組全長(zhǎng)約6.6kb，包含三個(gè)開(kāi)放閱讀框：ORF1，位于基因的5’端，編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白；ORF2，位于基因的3’端，編碼病毒衣殼蛋白；ORF3與ORF2部分重疊，對(duì)其研究很少。
　　 本研究針對(duì)禽HEVORF3蛋白，進(jìn)行了整段與分段原核表達(dá)，將表達(dá)獲得的完整ORF3蛋白

3、免疫小鼠，利用常規(guī)的雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備與篩選單抗，獲得三株穩(wěn)定分泌抗ORF3蛋白的雜交瘤細(xì)胞系，命名為6E9、3F3、2C9，其亞型分別為IgG1、IgG2b、IgG1，間接ELISA與Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，三株單抗識(shí)別的抗原表位均位于ORF3蛋白C端74aa-88aa，競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果顯示，3F3與2C9識(shí)別同一抗原表位，而6E9與前兩者共享部分抗原表位。同時(shí)我們利用分段蛋白對(duì)臨床存在ORF3蛋白抗體陽(yáng)性的雞血清進(jìn)行了

4、ELISA和Westernblot檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示臨床血清中存在針對(duì)1-27aa、55-74aa和74-88aa三個(gè)抗原區(qū)的抗體。而將陽(yáng)性雞血清分別與三株單抗的競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果顯示，44％的陽(yáng)性血清中存在與2C9識(shí)別同一表位的抗體。
　　 為進(jìn)一步研究ORF3蛋白的不同抗原區(qū)，我們利用桿狀病毒表達(dá)體系真核表達(dá)了ORF3蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析、Westernblot和間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)，結(jié)果表明，ORF3蛋白在昆

5、蟲細(xì)胞sf9中成功獲得了表達(dá)。將純化的蛋白免疫小鼠，成功制備了ORF3蛋白的多抗血清，將該血清分別與原核表達(dá)的分段蛋白進(jìn)行ELISA與Westernblot反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該血清識(shí)別的抗原位點(diǎn)集中在aa74-88。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，禽HEVORF3蛋白的主要免疫顯性抗原區(qū)位于蛋白C端的aa74-88位置，而1-27aa和55-74aa區(qū)域其抗原性較弱。
　　 已有研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物HEV除了ORF2蛋白含有病毒主要的抗原表位，