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文檔簡介
1、2001年,Haqshenas等從患有肝脾腫大(Hepatitis-splenomegaly,HS)綜合癥的雞膽汁中首次分離和描述了禽HEV的全基因組序列。2010年,趙欽等首次分離并描述了國內(nèi)禽HEV的全基因組,序列分析發(fā)現(xiàn)與其它國家禽HEV的同源性為77.3%-95.5%。禽HEV感染主要引起30-70周齡的蛋雞和肉種雞的死淘率升高(1%)和產(chǎn)蛋率下降(20%-40%),感染雞通常腹部紅腫,卵巢退化,偶有雞肝脾腫大、肝壞死和出血。血
2、清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病毒的感染在許多國家中已廣泛流行,而我國部分地區(qū)的雞群血清陽性率也達到了30%左右。
禽HEV屬于肝炎病毒屬,為單股正鏈RNA,基因組全長約6.6kb,包含三個開放閱讀框:ORF1,位于基因的5’端,編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白;ORF2,位于基因的3’端,編碼病毒衣殼蛋白;ORF3與ORF2部分重疊,對其研究很少。
本研究針對禽HEVORF3蛋白,進行了整段與分段原核表達,將表達獲得的完整ORF3蛋白
3、免疫小鼠,利用常規(guī)的雜交瘤細胞技術(shù)制備與篩選單抗,獲得三株穩(wěn)定分泌抗ORF3蛋白的雜交瘤細胞系,命名為6E9、3F3、2C9,其亞型分別為IgG1、IgG2b、IgG1,間接ELISA與Westernblot檢測結(jié)果顯示,三株單抗識別的抗原表位均位于ORF3蛋白C端74aa-88aa,競爭ELISA結(jié)果顯示,3F3與2C9識別同一抗原表位,而6E9與前兩者共享部分抗原表位。同時我們利用分段蛋白對臨床存在ORF3蛋白抗體陽性的雞血清進行了
4、ELISA和Westernblot檢測。實驗結(jié)果顯示臨床血清中存在針對1-27aa、55-74aa和74-88aa三個抗原區(qū)的抗體。而將陽性雞血清分別與三株單抗的競爭ELISA結(jié)果顯示,44%的陽性血清中存在與2C9識別同一表位的抗體。
為進一步研究ORF3蛋白的不同抗原區(qū),我們利用桿狀病毒表達體系真核表達了ORF3蛋白,經(jīng)SDS-PAGE分析、Westernblot和間接免疫熒光(IFA)檢測,結(jié)果表明,ORF3蛋白在昆
5、蟲細胞sf9中成功獲得了表達。將純化的蛋白免疫小鼠,成功制備了ORF3蛋白的多抗血清,將該血清分別與原核表達的分段蛋白進行ELISA與Westernblot反應(yīng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)該血清識別的抗原位點集中在aa74-88。綜合上述實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),禽HEVORF3蛋白的主要免疫顯性抗原區(qū)位于蛋白C端的aa74-88位置,而1-27aa和55-74aa區(qū)域其抗原性較弱。
已有研究發(fā)現(xiàn),哺乳動物HEV除了ORF2蛋白含有病毒主要的抗原表位,
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