C反應蛋白介導脂質(zhì)紊亂參與動脈粥樣硬化早期形成的研究.pdf

1、第一章 CRP誘導內(nèi)皮細胞炎癥相關因子的表達 目的：通過CRP直接處理內(nèi)皮細胞誘導炎癥相關蛋白及mRNA的改變，探討不同濃度的CRP對內(nèi)皮細胞是否具有直接的致炎作用。 方法：分別通過細胞ELISA法檢測空白對照組，1 mg/L CRP組、5 mg/L CRP組、CRP 20mg/L組對內(nèi)皮細胞誘導ICAM-1、以及可誘導型-氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase iNOS)在人臍靜脈內(nèi)皮

2、細胞的表達；RT-PCR法檢測空白對照組，1mg/L、5mg/L、10mg/L及20mg/LCRP誘導內(nèi)皮細胞ICAM-1mRNA表達的變化。 結果：對于ICAM-1的誘導與對照組沒有顯著差異(P>0.05)，而CRP 20mg/L組較其它組對ICAM-1有顯著的增加(P<0.01)。空白對照組，1mg/LCRP組與5mg/L CRP組對于iNOS的誘導與對照組沒有顯著差異(P>0.05)，而CRP 20mg/L組較其它組對iN

3、OS有顯著的增加(P<0.01)。同樣，RT-PCR結果顯示只有20 mg/LCRP可以明顯提高ICAM-1 mRNA的表達。 結論：雖然目前有研究認為高水平CRP可以誘導炎癥相關蛋白在內(nèi)皮細胞的表達，但是本研究通過細胞ELISA法及RT-PCR法檢測CRP對內(nèi)皮細胞誘導炎癥相關蛋白及其mRNA表達后認為，CRP在正常生理水平對內(nèi)皮細胞的炎癥相關蛋白及mRNA表達影響不大，僅在較高濃度情況下才可能對內(nèi)皮細胞誘導炎癥相關因子表達產(chǎn)

4、生影響，因此如何解釋CRP在0～10 mg/L的正常生理水平條件下參與動脈粥樣硬化形成的過程，以及是否有其他因素參與值得進一步探討。 第二章 CRP致內(nèi)皮細胞炎癥相關細胞信號轉導通路篩選 目的：本研究通過特異性和敏感性較高的低通量信號轉導通路基因芯片，探討高濃度的CRP處理對內(nèi)皮細胞信號轉導通路的影響。 方法：設CRP處理組以及對照組，分別給予20 mg/L CRP或磷酸鹽緩沖液(PBS)與培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞

5、進行處理24 h，然后提取RNA進行基因芯片檢測，采用的基因芯片共包含18個信號轉導通路：促有絲分裂通路、Wnt通路、Hedgehog通路、TGF-p通路、Survival通路、p53通路、應激通路、NF-rd3通路、NFAT通路、CREB通路、Jak-Stat通路、雌激素通路、雄激素通路、鈣與蛋白激酶C通路、磷脂酸C通路、胰島素通路、低密度脂蛋白通路、維甲酸通路。 結果：CRP處理組較對照組分別有13種基因表達增加、25種基因

6、表達降低。CRP處理組信號通路增加最顯著的是WISP家族的表達增強，尤其WISP2，達到37.63倍；誘導凋亡關鍵信號通路p53相關基因表達增加30.5倍，而抑制凋亡相關信號通路Bcl-x相關基因表達降低10.41倍。 結論：以往針對CRP誘導內(nèi)皮細胞信號轉導通路激活主要集中NF-kB通路和MAPKs系統(tǒng)，本研究通過基因芯片對參與信號轉導的18條主要通路進行篩選，結果發(fā)現(xiàn)CRP對于傳統(tǒng)認為可以激活例如ICAM、VCAM、iNOS

7、等炎癥相關的信號通路在本研究均沒有顯著改變或低水平改變，而對于WISP及凋亡相關信號通路有較明顯的改變。目前認為WISP家族是一族與細胞增殖相關生長因子，在某些炎癥條件下例如類風濕關節(jié)炎被激活，參與炎癥過程，尤其是WISP2在慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展中起相當關鍵的作用，本實驗證實CRP有可能是WISP2激活的直接因素，從而可能進一步調(diào)控內(nèi)皮系統(tǒng)炎癥的發(fā)生。本研究同時發(fā)現(xiàn)p53信號顯著增強，達到對照組30.50倍，而bcl-x和bcl-2相關基

8、因則分別下調(diào)10.4倍和2.01倍。其中p53是調(diào)節(jié)細胞周期和介導細胞凋亡最關鍵的信號通路之一，參與調(diào)控超過60種基因表達，而后兩者則是抑制細胞凋亡最關鍵的信號通路。因此得出結論，高于正常生理水平的CRP可能確實參與內(nèi)皮系統(tǒng)的炎癥發(fā)生，其機制可能是通過誘導細胞凋亡及激活細胞增殖相關蛋白信號通路的表達。 第三章 CRP介導E-LDL誘導內(nèi)皮細胞損傷的研究 目的：通過分析CRP的特殊結構和功能，結合LDL研究，探討CRP在動

9、脈粥樣硬化形成中可能具有的中間介質(zhì)作用。 方法：本研究參考文獻改進LDL提取方法，通過一次性密度梯度超速離心，分離LDL，并且通過復合酶處理以及銅離子氧化法分別生成E-LDL和ox-LDL，并直接對CRP及LDL進行熒光標記，通過與內(nèi)皮細胞共孵育，利用熒光顯微鏡檢測CRP及LDL與內(nèi)皮細胞結合，實驗分為8組：空白對照組、CRP組、N-LDL組、ox-LDL，組、E-LDL組、CRP+N-LDL組、CRP+ox-LDL組、CRP+

10、E-LDL組。 結果： 1)通過超速密度梯度離心一次性提取LDL和LPDS，改進了過去提取LDL需要2次超速離心，每次需要離心24-48小時的方法； 2)FITC可以直接對CRP進行標記，不干擾CRP的受體和配體結合位點，對CRP的生理功能沒有明顯的影響； 3)N-LDL和E-LDL不能夠被內(nèi)皮細胞識別，ox-LDL對內(nèi)皮細胞有微弱的結合能力； 4)在CRP共孵育條件下，天然LDL和ox-LDL

11、不能夠聯(lián)結內(nèi)皮細胞，而E-LDL可以高親和力與CRP結合，從而形成CRP/E-LDL復合體與內(nèi)皮細胞結合。 結論： CRP是一種雙面五聚體結構，每個單體的配體識別位點或受體結合位點分別位于五聚體兩個平面上，分別組成配體識別相和效應器相，從而構成特殊的二相性結構。由于CRP的識別相可以結合被暴露出磷酸膽堿結構的E-LDL，形成E-LDL/CRP復合體，而內(nèi)皮細胞表面能以高親和力識別CRP的配體相，從而CRP二相性結構具有結合E-L

12、DL，被內(nèi)皮細胞捕獲，引起脂質(zhì)沉積和激活補體、觸發(fā)炎癥反應的可能性，這樣可以解釋早期動脈粥樣硬化為何同時存在E-LDL、CRP、補體，而這三種物質(zhì)在同時、同地出現(xiàn)絕非一個巧合。由此得出結論，CRP是一種保守蛋白，在正常生理水平主要參與壞死、凋亡細胞的清除，但是在脂質(zhì)代謝紊亂的情況下，能夠介導異常脂質(zhì)尤其是E-LDL參與動脈粥樣硬化的形成。 總結： 1)CRP是一種保守蛋白，在正常生理水平下對內(nèi)皮細胞沒有明顯的誘導炎癥發(fā)生

13、的作用，僅在高濃度條件下有可能誘導細胞炎癥相關蛋白及mRNA的表達； 2)高于生理水平的CRP對內(nèi)皮細胞的致炎作用主要通過誘導細胞凋亡及激活細胞增殖相關蛋白信號通路的表達； 3)CRP是一種雙面五聚體蛋白，結構具有特殊的二相性，能夠分別結合內(nèi)皮細胞和E-LDL。因此，正常生理水平的CRP不能誘導內(nèi)皮細胞的炎癥損傷，但是在有脂質(zhì)代謝紊亂的條件下，能夠介導E-LDL參與內(nèi)皮損傷，補體激活，從而觸發(fā)動脈粥樣硬化早期形成的過程。