布魯氏菌病與萊姆病膠體金免疫層析試紙條的研制.pdf

1、布魯氏菌病是由布魯氏桿菌侵入機體而引起的慢性細菌性人畜共患病。布魯氏菌可感染人類、多種家畜和野生動物,嚴重影響著畜牧業(yè)的發(fā)展和公共衛(wèi)生安全。因此,針對該病研發(fā)出快速、有效的診斷方法是非常必要的。目前,針對該病的診斷國內外學者相繼建立了許多方法,雖然有些方法頗有成效,但存在著價格高、操作繁瑣、專業(yè)性強等缺點而不適合基層布病的準確診斷。因此,建立一種廉價、敏感性高、特異性好、操作方便、適用于基層布病快速診斷的方法迫在眉睫。本研究基于布魯氏菌

2、表面蛋白以膠體金為標記材料建立了一種布魯氏菌病快速診斷方法,為基層布病準確、快速、簡便的大量初步篩查提供技術支持。
　　萊姆病是一種由蜱傳播疏螺旋體而引起的人畜共患病,該病能引起人和動物的多個組織器官的損傷。感染伯氏疏螺旋體的人和動物大多經歷萊姆病的多個時期,且各個時期呈現(xiàn)不同的臨床癥狀,極容易與其它疾病混淆,嚴重的危害著公共衛(wèi)生安全。目前,國內對該病在診斷方面的研究甚少?；诓鲜杪菪w外膜蛋白抗原具有一定的免疫原性的特點,本研

3、究通過原核表達的方法獲得萊姆病螺旋體抗原蛋白,并對其血清學檢測方法進行了初步研究。
　　目的:建立一種新的布魯氏菌病及萊姆病螺旋體膠體金免疫層析檢測方法。
　　本文對布魯氏菌病和萊姆病兩個新疆高發(fā)的人獸共患病主要研究成果報告如下:
　　1.布魯氏菌表面蛋白的純化及驗證:使用親和層析的方法對實驗室保存的布魯氏菌表面蛋白BP26、VirB5、SP41及OMP31進行純化,通過WB試驗和ELISA試驗驗證四個表面蛋白的反應原

4、性和免疫原性。結果顯示:獲得了高純度的重組蛋白,且四個融合蛋白均具有良好的免疫原性和反應原性,為后續(xù)布魯氏菌病免疫層析試紙條的制備奠定了堅實的基礎。
　　2.布魯氏菌病免疫層析檢測試紙條的制備:以純化的布魯氏菌表面蛋白BP26、VirB5、SP41及OMP31為檢測抗原,利用檸檬酸三鈉還原氯金酸的方法制備膠體金免疫層析試紙條,對反應的各個條件進行了優(yōu)化,最終使用布病VirB5蛋白制備出膠體金免疫層析試紙條。用琥紅平板凝集試驗、試管

5、凝集試驗及制備的免疫層析試紙條分別對166份綿羊血清樣本進行檢測:陽性率分別為34.3％(57/166)、36.7%(61/166)、和36.1%(60/166), RBPT檢出的57份陽性均能被試紙條檢出,與試管凝集符合率為98.4%。整個檢測過程在10min內便可完成;制備的免疫層析試紙條具有準確性高、敏感性好、操作簡便的特點。
　　3.萊姆病伯氏疏螺旋體外膜蛋白OspA和BmpA的原核表達、純化及驗證:構建萊姆病伯氏疏螺旋體

6、OspA和BmpA原核表達系統(tǒng),使用親和層析對蛋白OspA和BmpA進行純化,通過WB驗證蛋白的反應原性。結果顯示:獲得了高純度的重組蛋白,且融合蛋白均具有良好的反應原性,為進一步制備萊姆病免疫層析試紙條奠定基礎。
　　4.萊姆病螺旋體快速診斷試紙條的制備:膠體金制備的方法、膠體金顆粒的質量鑒定及抗原標記條件均同布魯氏菌病免疫層析試紙條制備一致,以萊姆病外膜蛋白 OspA和BmpA分別作為檢測抗原,制備膠體金免疫層析試紙條并對其特

7、異性、敏感性等作出評價。結果顯示:試紙條最高可檢出兔萊姆病標準陽性血清為1:200。20份疑似萊姆病的綿羊血清樣本中共檢出2份陽性,與標準法western blot檢測的符合率為100%。整個檢測過程在10min內便可完成;本試紙條在4℃冰箱中可保存半年以上。
　　結論:成功表達、純化了布魯氏菌的四個表面蛋白并首次以表面蛋白VirB5為診斷抗原制備出膠體金免疫層析試紙條;構建了萊姆病OspA、BmpA基因的原核表達系統(tǒng),并在國內首