大鼠肝星狀細(xì)胞分離鑒定及缺氧條件下MMP-2基因表達(dá)調(diào)控.pdf

1、全文分為二部分： 第一部分：大鼠肝星狀細(xì)胞的分離培養(yǎng)鑒定。 [目的]：為研究肝纖維化的分子機(jī)制，提供充足的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells.HSCs)。 [方法]：禁食12小時(shí)的成年雄性Sprague-Darwley大鼠，先后用D-Hank’s和含有Ⅳ型膠原酶的D-Hank’S灌流，再用含有Ⅳ型膠原酶和DNA酶的溶液37℃中孵育灌流后肝臟25-30分鐘分離人鼠HSCs，18％的Nycode

2、nz梯度密度離心法純化HSCs。DMEM培養(yǎng)基、10％胎牛血清、5％CO<,2>、飽和濕度以及37％條件下培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，免疫熒光法測(cè)細(xì)胞內(nèi)Desmin和α-SMA表達(dá)。 [結(jié)果]：肝星狀細(xì)胞得率約為1xl0<'7>/鼠肝，純度>80％，存活率為90％。 [結(jié)論]：原位灌流法是一種可靠、有效的大鼠肝星狀細(xì)胞分離方法。 第二部分：缺氧誘導(dǎo)因子-1α對(duì)肝星狀細(xì)胞中MMP-2基因表達(dá)的調(diào)控作用。 [

3、目的]：①了解HSCs在缺氧情況下基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)基因的激活是否與缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)有關(guān)。②了解肝細(xì)胞(hepatocytes，HC)在缺氧條件下是否對(duì)HSCs表達(dá)MMP-2以及對(duì)酶活性有影響。 [方法]：①合成MMP-2基因上含有缺氧應(yīng)答元件(hypoxia response eleme

4、nt，HRE)的一段寡核苷酸序列(23bp)，克隆入pGL-3promoter，構(gòu)建重組載體pGL-3mmp2。②通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pGL-3mmp2到大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)，細(xì)胞培養(yǎng)24-48小時(shí)后，用化學(xué)缺氧法(培養(yǎng)基中加COCl<,2>)模擬缺氧狀態(tài)6小時(shí)，然后測(cè)定熒光素酶活性(Luc)。③運(yùn)用網(wǎng)站生物軟件分析HIF-1αmRNA全長(zhǎng)，按照評(píng)分挑選兩條得分最高的干涉序列，連接到RNA干涉(RNAinterference)專(zhuān)用載

5、體，經(jīng)測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)染到HSCs中，培養(yǎng)48小時(shí)后用RT-PCR法檢測(cè)HIF-1α的mRNA變化，以確定干涉效果。@HSCs和HC雙層共培養(yǎng)，其比例約為10:1。無(wú)血清缺氧培養(yǎng)后，取上清采用明膠酶譜法檢測(cè)上清MMP-2活性以及RT-PCR法檢測(cè)HSCsMMP-2核酸(mRNA)水平表達(dá)變化。 [結(jié)果]：①經(jīng)測(cè)序鑒定，所克隆的基因片段與預(yù)期完全一致，序列無(wú)堿基突變。②轉(zhuǎn)染pGL-3mmp2的HSCs熒光素酶活性平均值明顯高于空載質(zhì)粒