粉防己堿對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的調(diào)控.pdf

1、目的:觀察不同濃度粉防己堿(tetrandfine:Tet)對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell; HSC)增殖及細(xì)胞周期素D1、E(cyclinD1、E)和增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen:PCNA)表達(dá)的影響。研究Tet抗肝纖維化過程中的作用和機(jī)制，以期為臨床預(yù)防或治療肝纖維化和早期肝硬化提供理論依據(jù)。 方法:1.HSC的培養(yǎng):①從液氮罐中

2、取出細(xì)胞凍存管，迅速置入37℃水浴中，輕輕振蕩至凍存液完全溶解，此過程在1-2分鐘內(nèi)完成。75％酒精擦拭凍存管后打開，將凍存液吸入15ml無菌離心管中，邊滴加含10％胎牛血清(fetalbovine semm:FBS)的DMEM培養(yǎng)基邊振蕩混勻。1000r/min離心5min，吸棄上清液，重復(fù)洗一次，再加入含10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基3ml，接種于25ml培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后，更換培養(yǎng)基繼

3、續(xù)培養(yǎng)。②大鼠肝星狀細(xì)胞以含10％ FBS的RPMI 1640 37℃、5％CO2常規(guī)培養(yǎng)，隔天換液，當(dāng)細(xì)胞貼滿培養(yǎng)瓶瓶底約8096時(shí)，用0.25％胰蛋白酶消化貼壁的細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并將細(xì)胞及時(shí)凍存?zhèn)溆谩?.MTT法檢測(cè)HSC的增殖:①取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)0.25％胰蛋白酶消化，用含10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，以1×104/ml接種于96孔板中，置于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)7096融合，將細(xì)

4、胞分為五組:空白對(duì)照組(正常培養(yǎng)基，不加Tet)、0.25mg/LTet組(培養(yǎng)基含0.25mg/L Tet)、0.5mg/LTet組(培養(yǎng)基含0.5mg/L Tet)、1.0mg/L Tet組(培養(yǎng)基含1.0mg/L Tet)、2.0me/L Tet組(培養(yǎng)基含2.0mg/L Tet)，每組設(shè)12個(gè)復(fù)孔。②以無血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞三次，加入不同濃度Tet。Tet處理24h后，每孔加入MTr溶液(5mg/mll20μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后

5、終止反應(yīng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入15μl二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide;DMSO)，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)各孔波長(zhǎng)在490nm的光密度(optical density;OD)值，并以下列公式計(jì)算細(xì)胞抑制率(cellinhibition rate；CIR):細(xì)胞抑制率CIR=(空白對(duì)照組平均OD值-處理組平均OD值)/空白對(duì)照組平均OD值×100％。分析不同濃度Tet對(duì)HSC增

6、殖的影響。3.免疫細(xì)胞化學(xué)法(SABC法)檢測(cè)PCNA、cyclinD1和cyclinE的表達(dá)。①取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)0.25％胰蛋白酶消化；用含10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，以4 ×101/ml接種于置有經(jīng)多聚賴氨酸處理的蓋玻片的24孔板中，置于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)70％融合，將細(xì)胞分為3組:空白對(duì)照組(正常培養(yǎng)基，不加Tet)、0.5mg/LTet組(培養(yǎng)基含0.5mg/L Tet)、1.

7、0Tet組(培養(yǎng)基含1.0mg/L Tet)。②以無血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞三次，加入不同濃度Tet。Tet處理24h后，用PBS洗細(xì)胞3次，4％多聚甲醛固定細(xì)胞15min，0.3％Tri-ton- X-100通透細(xì)胞30min，過氧化物酶阻斷劑孵育l0min，非免疫性動(dòng)物血清中孵育l0min，加一抗4℃冰箱過夜后，生物素標(biāo)記的二抗中孵育10min，加SABC復(fù)合物孵育10min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，

8、顯微鏡下觀察，照相。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。每組細(xì)胞各進(jìn)行6次獨(dú)立性實(shí)驗(yàn)。③PCNA、cyclinD1、cyclinE陽性結(jié)果判斷:PCNA染色;細(xì)胞核著色，染成棕黃(褐)色為陽性，淺(灰)藍(lán)色視為陰性；cyclinD1、cyclinE染色:細(xì)胞核著色，染成棕黃(褐)色為陽性，淺(灰)藍(lán)色視為陰性。 在400倍鏡下，PCNA、cyclinD1、cyclinE指數(shù)通過隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，每視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)

9、作為計(jì)數(shù)指標(biāo)。 結(jié)果:①空白對(duì)照組、0.25mg/L Tet組、0.5mg/L Tet組、1.0mg/L Tet組和2.0mg/L Tet組細(xì)胞增殖抑制率分別為0，2.73％，14.75％，25.96％，33.06％，Tet在0.5mg/L-1.0mg/L的范圍內(nèi)顯著(P<0.05)抑制大鼠肝星狀細(xì)胞的增殖，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，但是1.0m/L與2.0mg/L Tet對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞的增殖抑制作用無顯著性差異。②0.5mg/L

10、、1.0mg/LTet濃度組PCNA陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯減少，與對(duì)照組比較差異有顯著性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；1.0mg/L Tet組PCNA陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)又比0.5mg/L Tet組明顯減少，兩濃度組之間也存在顯著性差異(P<0.01)。⑨0.5mg/L、1.0mg/L Tet濃度組cyclinD1陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯減少，與對(duì)照組比較差異有顯著性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；1.0mg/L Tet組cycl

11、inD1陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)又比0.5mg/LTet組明顯減少，兩濃度組之間也存在顯著性差異(P<0.01)。④0.5mg/L、1.0m/LTet濃度組cyclinE陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯減少，與對(duì)照組比較差異有顯著性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)；1.0mg/L Tet組cyclinE陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)又比0.5mg/L Tet組明顯減少，兩濃度組之間也存在顯著性差異(p<0.01)。 結(jié)論:Tet可呈濃度依賴性的抑制大鼠肝星狀細(xì)