鼠肝星狀細胞分離方法匯總

1、1、大鼠原代肝星狀細胞的分離培養(yǎng)方法匯總：方法一雄性SD大鼠，體重400—500g。[操作步驟]1.大鼠以戊巴比妥鈉麻醉，同時皮下注射5000U肝素鈉抗凝；2.皮膚常規(guī)消毒后打開腹腔，鈍性分離門靜脈及下腔靜脈；3.以16號套管針作門靜脈插管，37℃灌注DHanks液，10mlmin至肝臟充盈，剪開下腔靜脈放血后結(jié)扎。立即打開胸腔，以16號套管針作上腔靜脈插管，形成門靜脈上腔靜脈循環(huán)；4.以0.1％鏈霉蛋白酶E5mLmin灌注34分鐘，0

2、.03％Ⅱ型膠原酶5mlmin灌注34分鐘；5取出肝臟，去肝包膜，用眼科剪剪碎。加入鏈霉蛋白酶E至終濃度為0.006％、DNA酶至終濃度為10pugml。37℃5％C02孵箱內(nèi)消化30分鐘；6.過200目篩網(wǎng)，培養(yǎng)液洗4次，將細胞鋪于制備好梯度的細胞分離管中，對照管中加入等量培養(yǎng)液7.4℃800g平拋離心30分鐘。吸取1.040密度層的上層細胞，培養(yǎng)液洗2次；8.加入五血清RPMll640培養(yǎng)液，于37℃5％C02孵箱孵育15分鐘：吸取

3、細胞懸液，在6孔板中以含20％胎牛血清的RPMl1640培養(yǎng)。24小時后換液，此后每3天換液1次。方法二：[動物]雄性純種Wistar大鼠，體重400500g，普通飼料喂養(yǎng)。[操作步驟]1.大鼠用戊巴比妥鈉麻醉，無菌操作下打開腹腔；2.經(jīng)門靜脈肝素化，取出肝臟，灌流液灌注1020分鐘(37℃)，至肝細胞略顯黃色；3.鏈霉蛋白酶E溶液(0.02％)反復(fù)灌注1020分鐘(40—41℃)，膠原酶溶液反復(fù)灌注1015分鐘(40—4l℃)，至肝組

4、織完全軟化；4.兩液合于器皿中，鈍性撕碎肝組織，置三角燒瓶內(nèi)37~C下振蕩消化20分鐘，三層紗布過濾；5.無鈣培養(yǎng)液洗2次，將細胞懸液加至三層非連續(xù)密度梯度最上層(從下至上為1.080、1.058、1.053)，再在上面加一層無鈣培養(yǎng)液，16000r／min離心30分鐘(20℃)；6.輕輕吸取上層培養(yǎng)基與1.053層之間的細胞，細胞經(jīng)無鈣培養(yǎng)液洗2次后，調(diào)成(15)XlO5ml濃度，接種于50ml培養(yǎng)瓶(內(nèi)含20％小牛血清的RPMl16

5、40培養(yǎng)液)；7.培養(yǎng)28h后換含新鮮10％小牛血清的RPMl1640培養(yǎng)液，以后每隔3—4天換液1次。液體配制：1、預(yù)灌注液：葡萄糖1gL、HEPES2.38gL的DHanks，pH7.27.4，過濾除菌2、鏈酶蛋白酶（現(xiàn)用現(xiàn)配）：鏈酶蛋白酶50mg，DHank50ml3、膠原酶（現(xiàn)用現(xiàn)配）：膠原酶12.5mg，DHank50ml4、震蕩液（現(xiàn)用現(xiàn)配）：鏈酶蛋白酶40mg，DHank50ml5、Nycodenze液：10.387%和1

6、8.8%兩種濃度分離方法1、灌注：乙醚麻醉，碘伏消毒大鼠腹部，U形打開腹腔暴露肝臟，門靜脈插管，預(yù)灌注液39℃灌注20mlmin至肝臟完全變白，輸液管前段一1ml肝素稀釋液代替，40℃鏈酶蛋白酶液和37℃膠原酶液510mlmin離體循環(huán)灌注各30min2、再次消化：將肝臟移入超凈工作臺已硅化的培養(yǎng)皿中，去除被膜，小剪刀剪碎，倒入有震蕩液的硅化三角瓶中，水浴搖床震蕩30min（200250次），向三角瓶內(nèi)加入4℃的DMEM20ml、DNa

7、se5ml，加DHank至45ml，充分輕輕吹打，離心棄上清，再重復(fù)1遍，棄上清，加DMEM約7.5ml，混勻懸液3、密度梯度50ml離心管，先加10.387%Nycodenze10ml，再將吸管深入到試管底部慢慢勻速加入18.8%的Nycodenze10ml，再在液面上緩慢加入細胞懸液20000rmin離心25min10℃加速離心后，可見上面的一層白色細胞層為未活化的星狀細胞，小心吸出至2個15ml的離心管內(nèi)4、洗滌提純HSC向離心管

8、中加入新的DMEM至12ml，充分吹打混懸，洗滌3次，用喊20%胎牛血清的DMEM懸浮，40g離心，棄沉淀。5、培養(yǎng)方法取1滴懸液至計數(shù)板上，蓋上蓋玻片，在倒置顯微鏡下觀察技術(shù)細胞1106接種于6孔板，12h后換液，以后每3天換一次6、細胞活率鑒定臺酚藍拒染實驗：取2滴細胞懸液加2滴0.4%臺酚藍，混勻，3min內(nèi)計數(shù)活細胞數(shù)7、HSC純度鑒定Desmin和GFAP免疫細胞組化鑒定在接種細胞前向培養(yǎng)孔內(nèi)滴入1滴無菌PBS，將用多聚賴氨酸