雙歧桿菌表達重組人GraB-VRB融合蛋白誘導(dǎo)KDR陽性細胞凋亡.pdf

1、南方醫(yī)科大學(xué)2009級碩士學(xué)位論文可雙歧桿菌表達重組人GraBVRB融合蛋白對KDR陽性細胞的影響GranzymeBVEGFReceptor—BindingPeptide(GraB—VRB)FusionProteinExpressedinBtongumInducesApoptosisofKDRpositiveCells課題來源：廣東省醫(yī)學(xué)研究基金(項目：A2009412)專業(yè)名稱學(xué)位申請人指導(dǎo)教師答辯委員會主席答辯委員會成員腫瘤學(xué)陳蕾鄭

2、航副教授曾位森副研究員陳龍華教授李金瀚教授李宇紅教授宋立兵教授張文清教授論文評閱人張為民教授袁亞維教授2011年6月2日廣州中文摘要GraBVRB融合蛋白能否作用于KDR陽性的血管內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞及其作用，為口服這種工程化雙歧桿菌使之在腸道內(nèi)表達重組GraBVRB，靶向性地作用于新生血管內(nèi)皮細胞，治療有關(guān)腸道腫瘤提供一定的實驗依據(jù)。2方法21細菌及細胞的培養(yǎng)雙歧桿菌接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)。各種細胞株均培養(yǎng)于含10％NCS

3、的RPMI1640培養(yǎng)基中，置37℃，5％C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2d換液傳代1次。將細胞洗滌后供實驗用，實驗用細胞為狀況良好的對數(shù)生長期細胞。22重組表達載體轉(zhuǎn)化雙歧桿菌采用電穿孔法。在電壓25kV、電容25心、電阻200Q條件下，將3種重組表達載體分別轉(zhuǎn)入雙歧桿菌。將轉(zhuǎn)化后雙歧桿菌接種于含60pg／ml氨芐西林的MRS固體選擇培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)。挑取乳白色、圓形邊緣光滑完整的陽性菌落，接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)。23重

4、組蛋白的誘導(dǎo)表達為了將外源基因轉(zhuǎn)化雙歧桿菌的表達產(chǎn)物直接用于有關(guān)細胞實驗中，重組蛋白的誘導(dǎo)表達在PRMI1640培養(yǎng)液(用丙酸調(diào)節(jié)pH值65左右)中進行。基因轉(zhuǎn)化雙歧桿菌接種于PRMI1640培養(yǎng)基后，37℃厭氧培養(yǎng)至OD650nm為06“10時，加終濃度為02％的L邛可拉伯糖誘導(dǎo)表達培養(yǎng)24h。取樣分離上清和茵體進行鑒定。小量分裝培養(yǎng)上清，70℃保存?zhèn)溆谩?4ELISA采用VEGFELISA試劑盒測定培養(yǎng)上清中d1VRB的含量，以Gr

5、aBELISA試劑盒測定培養(yǎng)上清中rhGraB和rhGraBVRB的含量，操作按ELISA試劑盒說明書進行。培養(yǎng)上清中重組蛋白的濃度，根據(jù)ELISA測定結(jié)果和各重組蛋白的計算分子質(zhì)量折算為mol濃度。25免疫印跡分別取經(jīng)L邛可拉伯糖誘導(dǎo)表達24h的轉(zhuǎn)基因雙歧桿菌菌體和培養(yǎng)上清，經(jīng)樣品處理液煮沸處理后，進行SDSPAGE(12％凝膠)；電泳完成后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5％脫脂奶粉封閉過夜，加抗Grab單克隆抗體室溫反應(yīng)2h，洗滌后加