重組人GST-PD-1融合蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)及其生物學(xué)特性的研究.pdf

1、B7-CD28超家族是最具特征的共刺激分子家族,不僅提供重要的正性共刺激信號(hào)(B7-1/B7-2-CD28,ICOSL-ICOS)起始和維持T細(xì)胞針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答,而且也提供負(fù)性共刺激信號(hào)(B7-1/B7-2-CTLA-4,PD-L1/PD-L2-PD-1)下調(diào)和終止T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答.PD-1分子屬于CD28家族,是55KDa的Ⅰ型跨膜糖蛋白,胞外區(qū)包含一個(gè)IgV樣結(jié)構(gòu)域.此結(jié)構(gòu)域及胞外段的糖基化被認(rèn)為在與配體的結(jié)合中發(fā)揮重要的作

2、用.一、人PD-1基因全長(zhǎng)及胞外段的克隆和載體的構(gòu)建.根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的人PD-1的基因序列設(shè)計(jì)合成了胞外段特異性引物.采用RT-PCR方法從人外周血PHA刺激活化的T細(xì)胞中擴(kuò)增了PD-1的胸外段基因,裝入T克隆載體,測(cè)序正確后,在TOP10宿主菌中增殖PGEX-5X-3-PD-1質(zhì)粒,經(jīng)酶切和PCR鑒定后轉(zhuǎn)化BL21(DE3)表達(dá)菌株.設(shè)計(jì)合成PD-1全長(zhǎng)基因的特異性引物,經(jīng)RT-PCR克隆全長(zhǎng)片段(含5UTR),經(jīng)過(guò)對(duì)多個(gè)克隆的測(cè)序和重

3、組PCR克隆含有酶切位點(diǎn)的全長(zhǎng)基因,裝入pcDNA3.1載體,全長(zhǎng)基因測(cè)序正確.二、人GST-PD-1融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)和鑒定.在Lura細(xì)菌培養(yǎng)基中增殖BL21表達(dá)菌,采取一系列實(shí)驗(yàn)條件,包括降低溫度,縮短誘導(dǎo)時(shí)間等,均證實(shí)不能誘導(dǎo)可溶性GST-PD-1融合蛋白的表達(dá),而表達(dá)的蛋白主要集中在包涵體內(nèi).表達(dá)動(dòng)力學(xué)分析表明,應(yīng)用1mmol/L IPTG誘導(dǎo)5h可獲得最有效的表達(dá).實(shí)驗(yàn)室規(guī)模增殖表達(dá)菌,經(jīng)超聲裂解和離心,沉淀變性及復(fù)

4、性,透析后經(jīng)GST親和層析柱一步純化融合蛋白.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,純化后的PD-1-GST融合蛋白純度可達(dá)90％以上,定量為2mg/ml.應(yīng)用Western-blotting對(duì)融合蛋白進(jìn)行生物學(xué)鑒定,結(jié)果為約46KD的單一條帶.三、人GST-PD-1重組蛋白的生物學(xué)功能的初步研究.應(yīng)用該科室建立的PD-L1基因轉(zhuǎn)染的L929成纖維細(xì)胞株與人外周血T細(xì)胞在不同濃度的PHA存在條件下共育48小時(shí),采用空載體轉(zhuǎn)染的L929細(xì)胞株和GST作為對(duì)照,檢

5、測(cè)培養(yǎng)上清中的IL-2和IFN-γ的濃度.結(jié)果表明PD-L1-L929細(xì)胞與對(duì)照相比可以顯著抑制活化T細(xì)胞IL-2和IFN-γ的產(chǎn)生.GST-PD-1融合蛋白在較高的濃度下可部分逆轉(zhuǎn)PD-L1-L929細(xì)胞對(duì)這兩種細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制.以上結(jié)果表明,GST-PD-1融合蛋白可在BL21(DE3)細(xì)胞中高效表達(dá),經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性和純化可獲得高濃度、高純度的活性蛋白.但其中只有部分具有生物學(xué)活性,推斷由于復(fù)性的條件仍然并非最佳.在以后的實(shí)驗(yàn)中要