胰腺癌相關(guān)免疫原性膜抗原的篩查與鑒定.pdf

1、研究背景： 胰腺癌是一種發(fā)病隱匿、進展快、預后極差的惡性腫瘤。目前臨床早期診斷困難，治療效果不佳。胰腺癌相關(guān)膜抗原在實現(xiàn)細胞生物學功能等方面具有十分重要作用，并且目前已有研究證明胰腺癌患者血清內(nèi)確實存在腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體，如能夠通過膜生物學、細胞組分蛋白質(zhì)亞組學、免疫蛋白質(zhì)組學、膜蛋白質(zhì)組學等方法，大量篩查尋找到特異性較好的胰腺癌相關(guān)免疫原性膜抗原，則可為胰腺癌的早期臨床血清標志物診斷、分子影像診斷及免疫靶向治療等發(fā)揮重要作

2、用。 研究目的： 篩查胰腺癌相關(guān)免疫原性膜抗原，并對篩查出的候選膜抗原進行多層面的有效性驗證及相關(guān)功能的探討及研究。 研究方法： 大量培養(yǎng)、提取并純化經(jīng)典胰腺癌細胞株SW1990的膜蛋白，將膜蛋白通過二維雙向凝膠電泳(2-DE)進行分離，平行的2-DE凝膠分別行考馬斯亮藍染色和免疫印跡雜交(Western Blot)。收集并純化臨床上66例胰腺癌、24例慢性胰腺炎患者血清中的IgG，分別與膜蛋白2-DE平

3、行凝膠進行免疫印跡雜交。雜交陽性蛋白位點應用基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析與肽質(zhì)指紋庫(PMF)鑒定。應用NCBI、SWISS-PROT/TrEMBL、ExPASy等網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，對候選膜蛋白的基因序列、蛋白序列、蛋白結(jié)構(gòu)域、疏水性、蛋白功能等生物學信息進行查詢、分析，尋找其作為胰腺癌相關(guān)膜抗原的生物信息學依據(jù)。應用RT-PCR、Real-Time PCR、Western Blot等方法，分別在細胞株、

4、組織層面，從基因與蛋白質(zhì)兩個水平對篩查出的膜抗原進行有效性驗證，并比較不同胰腺癌細胞株、正常胰腺組織和胰腺癌組織中目的膜抗原的基因及蛋白表達水平的差異。應用siRNA干擾技術(shù)使目的VDACl基因表達敲減或沉默，探討、研究膜抗原VDACl與細胞生長增殖、細胞調(diào)亡等方面的關(guān)系。同時成功的完成了對胰腺癌細胞株SW1990膜蛋白表達的有效性分析。 實驗結(jié)果： 1. 胰腺癌細胞株SW1990膜蛋白與胰腺癌患者血清IgG免疫印跡雜交

5、共出現(xiàn)9個陽性點，與慢性胰腺炎IgG雜交所出現(xiàn)的2個陽性點無重復；質(zhì)譜分析鑒定出6個候選膜抗原：VDAC1、VDAC2、VDAC3、Prohibitin、Prohibitin2、COMT。 2. VDAC1、2、3為線粒體外膜蛋白，與線粒體物質(zhì)運輸、受體一配體識別、信號轉(zhuǎn)導等多方面功能有關(guān)；Prohibitin(PHB)、Prohibitin2為線粒體內(nèi)膜蛋白，抑制細胞DNA的合成，與細胞增殖密切相關(guān)。COMT與甲基團的轉(zhuǎn)運及細

6、胞內(nèi)源性物質(zhì)的代謝作用密切相關(guān)。 3. RT-PCR和/或Real-Time PCR實驗證明，候選膜抗原VDAC1、VDAC2、VDAC3、Prohibitin、Prohibitin2和COMT的基因在胰腺癌細胞株SW1990、AsPc、P3和Panc-1中均有表達。并且經(jīng)Western Blot實驗證明VDAC、VDAC1、VDAC2和COMT在胰腺癌細胞株SW1990、AsPc和P3中的蛋白表達水平均明顯高于正常胰腺組織。

7、 4. Real-Time PCR實驗證明，候選膜抗原VDAC1和Prohibitin2的基因在驗證的10例正常胰腺組織和胰腺癌組織中均有表達(100％)，并且VDAC1和Prohibitin2分別在4例胰腺癌組織(Ca3、7、8、9)和3例胰腺癌組織(Ca3、8、10)中的DNA表達水平明顯高于各自的正常胰腺組織。 5. 候選膜抗原VDAC1和Prohibitin2在組織中蛋白表達的Western Blot有效性驗證結(jié)果

8、表明，VDAC1和Prohibitin2在胰腺癌組織中的蛋白表達水平均明顯高于正常胰腺組織，二者蛋白表達水平的差異均具有顯著的統(tǒng)計學意義(p<.05)。 6. 干擾VDACl的siRNA/pRNAT-Hl.l/Hygro真核表達載體穩(wěn)定、作用特異，WesternBlot驗證轉(zhuǎn)染96h時干擾效率最佳(62.5％)。 7. MTT法測定生長曲線和平板克隆形成實驗結(jié)果表明，經(jīng)RNAi的胰腺癌細胞SW1990的細胞生長增殖明顯受

9、到抑制(p<0.01)。 8. 流式細胞儀檢測siRNA干擾后的SW1990細胞凋亡的實驗結(jié)果表明，VDACl-siRNA轉(zhuǎn)染后的胰腺癌SW1990細胞調(diào)亡數(shù)目明顯增加。 9. RNAi實驗證明，膜抗原VDAC1與凋亡相關(guān)基因bcl-xl、caspase-3、Bax、PARP密切相關(guān)，VDAC1目的基因沉默或敲減后，細胞凋亡機制上調(diào)、活躍。 10. Prohibitin-siRNA的序列設(shè)計特異、有效，可顯著敲減

10、目的Prohibitin的基因表達。 11. 完成了對胰腺癌細胞株SW1990膜蛋白表達的有效性分析。 實驗結(jié)論： 1. VDAC1、VDAC2、VDAC3、Prohibitin、Prohibitin2、COMT可能為胰腺癌相關(guān)免疫原性膜抗原。 2. VDAC1、2、3為線粒體外膜蛋白，與線粒體物質(zhì)運輸、受體一配體識別、信號轉(zhuǎn)導等多方面功能有關(guān)；Prohibitin(PHB)、Prohibitin2為線粒體內(nèi)膜蛋

11、白，抑制細胞DNA的合成，與細胞增殖密切相關(guān)。COMT與甲基團的轉(zhuǎn)運及細胞內(nèi)源性物質(zhì)的代謝作用密切相關(guān)。 3. 候選膜抗原VDAC1、VDAC2、VDAC3、Prohibitin、Prohibitin2和COMT的基因在胰腺癌細胞株SW1990、AsPc、P3和Panc-1中均有表達。并且VDAC、VDACl、VDAC2和COMT在胰腺癌細胞株SW1990、AsPc和P3中的蛋白表達水平明顯高于正常胰腺組織。 4. 候選

12、膜抗原VDAC1和Prohibitin2的基因在驗證的10例正常胰腺組織和胰腺癌組織中均有表達(100％)，并且在部分胰腺癌組織中呈顯著性高表達。 5. 候選膜抗原VDAC1和Prohibitin2蛋白在驗證的正常胰腺組織和8例胰腺癌組織中均有表達(100％)，而且在胰腺癌組織中蛋白水平呈顯著性高表達(p<0.05)。 6. VDAC1參與細胞的生長增殖，呈正相關(guān)；VDAC1參與細胞凋亡調(diào)控機制，呈負相關(guān)。 7.