NDVF蛋白抗原表位結(jié)構(gòu)域基因的表達(dá)及其免疫原性研究.pdf

1、新城疫(ND)又稱亞洲雞瘟,是由新城疫病毒(NDV)引起的一種具有高度傳染性的病毒性疾病。NDV病毒可引起雞、火雞、鴕鳥、鴿子、孔雀及其它野鳥等多種禽類發(fā)病。由于用于禽類的ND疫苗并不能完全阻止該病的發(fā)生,該病已造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。雖然我們對(duì)于造成免疫雞群發(fā)生新城疫流行的根本原因尚不明確,但流行毒株的變異很可能是其中的重要因素之一。研究證明,在NDV感染過(guò)程中,位于病毒囊膜上的融合蛋白(F蛋白)是病毒穿入細(xì)胞,使宿主細(xì)胞產(chǎn)生融合和溶血的

2、重要因子,同時(shí)也是病毒的主要保護(hù)性抗原。正因?yàn)槿绱?F蛋白已經(jīng)成為研究新城疫基因工程疫苗和DNA疫苗等新型疫苗的首選抗原。為了探索NDV F蛋白抗原表位結(jié)構(gòu)域基因在免疫應(yīng)答中的作用及其機(jī)理,本研究運(yùn)用分子克隆技術(shù),對(duì)NDV F蛋白抗原表位結(jié)構(gòu)域基因分別進(jìn)行了克隆、表達(dá)和免疫原性鑒定。 ⑴根據(jù)GenBank中登錄的NDV F48E9株F基因序列和載體pGEX-4T-1,pET-32-a的多克隆位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)5對(duì)引物,應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合

3、酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)從接種NDV F48E9株的雞胚尿囊液中擴(kuò)增出相應(yīng)大小的目的基因片段F509(509bp)、F1(81bp)、F2(108bp)、F3(105bp)、F4(102bp)。應(yīng)用添加互補(bǔ)性酶切位點(diǎn)的基因工程方法,將抗原表位基因片段F1、F2、F3拼接成多表位串聯(lián)基因F306(306bp)。將片段F509插入載體pGEX-4T-1中,片段F1、F2、F3、F4、F306插入載體pET-32-a并轉(zhuǎn)化宿主菌BL21,經(jīng)

4、雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/F509和pET-32-a/F306后,對(duì)F509和F306的核苷酸序列進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明本研究成功地克隆了NDV F蛋白抗原表位結(jié)構(gòu)域基因及其多表位串聯(lián)基因。 ⑵將上述構(gòu)建成功的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/F509、pET-32-a/F1、pET-32-a/F2、pET-32-a/F3、pET-32-a/F4和pET-32-a/F306轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,經(jīng)異丙基-β-D-硫代半

5、乳糖苷(IPTG)于37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h,表達(dá)出含有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白GST-F509和含有組氨酸(His)的融合蛋白His-F1、His-F2His-F3、His-F4、His-F306：對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行相應(yīng)的優(yōu)化,確定了最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度；對(duì)表達(dá)蛋白的可溶性進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明表達(dá)的融合蛋白均以包涵體形式存在；應(yīng)用優(yōu)化的原核表達(dá)條件對(duì)含有質(zhì)粒pGEX-4T-1/F509、pET-32-a/F1、pET-32

6、-a/F2、pET-32-a/F3、pET-32-a/F4和pET-32-a/F306的BL21菌進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá),通過(guò)反復(fù)凍融和超聲裂解誘導(dǎo)菌,獲得濃度較高的GST-F509和His-F1、His-F2His-F3、His-F4、His-F306包涵體蛋白,用十二烷基肌氨酸鈉加超聲波的方法使包涵體充分溶解,提取了大量的可溶性GST-F509和His-F1、His-F2、His-F3、His-F4、His-F306融合蛋白。 ⑶

7、通過(guò)Western-blot方法,用制備的鼠抗NDV陽(yáng)性血清分別與獲得的融合蛋白反應(yīng)。結(jié)果表明含F(xiàn)蛋白抗原表位結(jié)構(gòu)的融合蛋白GST-F509和His-F1、His-F2、His-F3、His-F306具有良好的反應(yīng)原性,而不含抗原表位的融合蛋白His-F4則不能發(fā)生此特異性反應(yīng)。利用上述純化的GST-F509和His-F1、His-F2、His-F3、His-F4、His-F306融合蛋白作為抗原分別免疫小鼠制備鼠抗NDV F基因片段的