比較蛋白質組學篩查鑒定胰腺癌多藥耐藥相關蛋白的實驗研究.pdf

1、背景：胰腺癌是消化道系統(tǒng)的惡性腫瘤，多數患者被發(fā)現時已是晚期，僅15～20％的患者有根治性手術切除機會。目前化療仍然是治療胰腺癌、改善預后和提高患者生活質量的一種重要的輔助治療方法。然而不同患者對化療的敏感性差異較大且存在著嚴重的多藥耐藥現象，從而導致化療效果不甚理想。雖然國內外許多學者對胰腺癌多藥耐藥的機制進行了大量的研究，發(fā)現與細胞膜轉運、能量代謝以及DNA損傷修復等相關的基因和蛋白在胰腺癌耐藥過程中可能發(fā)揮作用，但尚不能完全解釋其

2、發(fā)生和作用的機制。既往大量的研究結果提示胰腺癌多藥耐藥現象的發(fā)生不是由單一基因或蛋白改變所引起，而可能是由多種基因或蛋白呈網絡式共同作用的結果。本實驗室在前期分別采用小劑量梯度遞增法和大劑量藥物沖擊法建立了3株胰腺癌耐藥細胞亞株，并通過基因芯片技術篩查出大量可能與胰腺癌多藥耐藥相關的基因，且對其中篩選出的部分基因在mRNA水平和蛋白水平進行驗證。但到目前為止尚未發(fā)現何種基因在胰腺癌多藥耐藥的發(fā)生發(fā)展中起到了關鍵和決定性的作用。多藥耐藥的

3、發(fā)生既是一種多基因調控的現象，也是一種多蛋白調控的現象，其發(fā)生往往與一組蛋白質而不是一個或幾個蛋白的改變有關，況且基因的功能最終要由蛋白質來實現，因此本實驗擬在前期研究工作的基礎上，應用高通量篩查差異表達蛋白的實驗技術—蛋白質組學技術，在蛋白水平篩查胰腺癌多藥耐藥發(fā)生過程中表達水平發(fā)生改變的蛋白質的種類、數量和修飾，希望找到在胰腺癌耐藥發(fā)生過程中起到關鍵作用的一組蛋白質，從而對胰腺癌的多藥耐藥機制進行探討，為今后尋找胰腺癌的治療靶點或逆

4、轉多藥耐藥提供理論依據。 方法：1.通過CCK-8比色法檢測人胰腺癌細胞株SW1990及耐藥亞株SW1990/FU、SW1990/ADM和SW1990/GEM的耐藥指數。 2.通過雙向凝膠電泳(Two-dimensionalgelelectrophoresis，2-DE)分離親本株SW1990及耐藥亞株SW1990/ADM和SW1990/FU的總蛋白。 3.用ImgemMster圖像分析軟件來檢測雙向電泳實驗的可

5、重復性。 4.用ImgemMster圖像分析軟件來分析耐藥亞株SW1990/ADM、SW1990/FU及親本株SW19902-DE圖之間的相關性并篩查耐藥亞株SW1990/ADM和SW1990/FU與其親本株SW1990之間的差異表達蛋白。 5.應用質譜(MALDI-TOF-MS)鑒定所篩查出的差異表達蛋白。 6.應用RT-PCR技術對篩選出的部分差異表達蛋白在mRNA水平進行驗證。 結果：1.通過CCK

6、-8比色法檢測三株耐藥細胞亞株SW1990/FU、SW1990/ADM、SW1990/GEM較其親本株SW1990對相應誘導藥物的耐藥指數分別為339.7、11.9、56.6。 2.通過Clean-up試劑盒純化蛋白并用Bradford法測定蛋白濃度，方法成熟穩(wěn)定，上樣量一致。 3.通過2-DE(銀染及考染)從親本株SW1990及其耐藥亞株SW1990/ADM和SW1990/FU的總蛋白中分別分離出肉眼可見的蛋白點200

7、余個。 4.用ImgemMster圖像分析軟件分析2次重復實驗中2-DE圖的重復性，SW1990和SW1990/ADM的重復率均為0.62；SW1990和SW1990/FU的重復率分別0.74和0.72。 5.用ImgemMster圖像分析軟件分析親本株SW1990和耐藥亞株SW1990/ADM及SW1990/FU2-DE圖之間的線性相關系數分別為0.901和0.784。篩查出SW1990/ADM與SW1990之間差異在

8、1.5倍以上的蛋白點73個，其中上調的蛋白點26個，下調的47個；SW1990/FU與SW1990之間差異在1.5倍以上的蛋白點97個，其中在耐藥亞株中上調的蛋白點32個，下調的65個。 6.從表達差異最為顯著的蛋白點中選取9個，進一步通過質譜鑒定。其中SW1990/ADM與SW1990之間差異表達蛋白有Enolase1，OTTTHUMP00000030321；SW1990/FU與SW1990之間差異表達蛋白有Enolase1，

9、Heatshockprotein27，TriosephosphateIsomerase1和Putativeodorantbindingproteinag等。 7.通過RT-PCR技術在基因水平對HSP27的mRNA表達水平進行驗證，發(fā)現HSP27mRNA表達水平在SW1990/ADM、SW1990/FU和SW1990/GEM中較親本株均升高。 結論：1.胰腺癌耐藥亞株SW1990/ADM、SW1990/FU和SW1990

10、/GEM較其親本株SW1990相比，具有較高的耐藥性，且耐藥性可穩(wěn)定遺傳。 2.親本株SW1990及其耐藥亞株SW1990/ADM和SW1990/FU的2-DE圖的重復性較好(重復率均大于0.5)，SW1990和SW1990/ADM及SW1990和SW1990/FU的2-DE圖的相關性良好，提示2-DE方法可靠。 3.胰腺癌耐藥亞株SW1990/ADM及SW1990/FU與其親本株SW1990相比，有許多蛋白在表達水平發(fā)

11、生了顯著改變。提示可能有許多蛋白參與了胰腺癌細胞對化療藥物ADM及5-FU耐藥現象的發(fā)生，胰腺癌細胞的多藥耐藥現象可能是多種蛋白共同作用的結果。 4.經過質譜分析鑒定出Enolase1，Heatshock27，TriosephosphateIsomerase1和Putativeodorantbindingproteinag可能參與了胰腺癌多藥耐藥的發(fā)生。5.HSP27mRNA表達水平在SW1990/ADM、SW1990/FU和S