塞來昔布對去卵巢大鼠骨丟失的影響.pdf

1、目的：骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是以骨量減少，骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征的，致使骨的脆性增加而易發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病。其嚴(yán)重的并發(fā)癥是脆性骨折，其中最常見的骨折部位是髖部和脊椎。OP已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)公眾健康問題，據(jù)統(tǒng)計，2000年全球骨質(zhì)疏松骨折的發(fā)病例數(shù)為900萬，且新增病例數(shù)（特別是髖部骨折例數(shù)）隨年齡增長不斷增加，值得注意的是，其中75％的髖部骨折發(fā)生在女性。女性一生當(dāng)中發(fā)生髖部骨折的危險性大于乳腺癌、子宮

2、內(nèi)膜癌和卵巢癌的危險性的總和，這足以引起我們對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoprosis，PMOP）的重視。自然絕經(jīng)或人工絕經(jīng)造成的雌激素缺乏是發(fā)生PMOP的主要原因，絕經(jīng)誘導(dǎo)骨轉(zhuǎn)換增強(qiáng)，骨吸收和骨形成偶聯(lián)失衡，促進(jìn)骨丟失。雖然目前機(jī)制尚未明確，但研究發(fā)現(xiàn)雌激素水平下降，與多種可促進(jìn)破骨細(xì)胞形成、抑制破骨細(xì)胞凋亡的骨吸收因子合成增加相關(guān)。在骨組織中，環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）

3、由成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分泌，作為前列腺素（prostaglandin synthesis，PGS）合成的限速酶，通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞中前列腺素E2（prostaglandin-E2，PGE2）的合成間接誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成和骨吸收，PGE2是強(qiáng)烈的骨吸收刺激因子，研究表明絕經(jīng)后機(jī)體處于PGE2依賴的、以骨丟失為特征的促炎性反應(yīng)狀態(tài)。核因子（nuclear factor-kappa B，NF-κB）是一種多效性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的

4、生成、作用及凋亡。體外研究表明NF-κB可激活COX-2的轉(zhuǎn)錄，使其表達(dá)增加，刺激破骨細(xì)胞的分化，導(dǎo)致破骨細(xì)胞生成增多，骨吸收活動增強(qiáng)，推測在PMOP體內(nèi)骨微環(huán)境中NF-κB通過調(diào)控COX-2的表達(dá)增加，導(dǎo)致PGE2合成增多是PMOP的發(fā)病機(jī)制之一，通過抑制NF-κB活性，調(diào)節(jié)COX-2的表達(dá)對PMOP可能起到預(yù)防作用。本實(shí)驗(yàn)以去卵巢大鼠建立PMOP模型，通過對去勢大鼠給予選擇性COX-2抑制劑-塞來昔布等干預(yù)因素，觀察各組大鼠骨組織中

5、NF-κB p65及COX-2的表達(dá)及其之間的相關(guān)性，了解塞來昔布對去卵巢大鼠骨丟失的影響及可能的作用機(jī)制，進(jìn)而探討PMOP發(fā)病機(jī)制以及為臨床PMOP防治用藥選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.動物分組和PMOP動物模型制備
　　 3月齡成年雌性Sprague/Dawley大鼠40只，隨機(jī)分為4組，每組10只：①假手術(shù)（Sham）組、②卵巢切除（OVX）組、③卵巢切除+尼爾雌醇（OVX+E）組、④卵巢切除

6、+塞來昔布（OVX+C）組。將大鼠以10％水合氯醛（100mg/kg）腹腔注射麻醉，無菌條件下，經(jīng)腰背部正中縱行切口進(jìn)入腹腔背側(cè)，將②-④組大鼠切除雙側(cè)卵巢，①組大鼠切除雙側(cè)卵巢下方少許脂肪組織，重量約與卵巢相同。于去卵巢術(shù)后7天起，分別對各組大鼠進(jìn)行灌胃給藥，共12周。OVX+E組給予尼爾雌醇1.0mg·kg-1·w-1，OVX+C組給予塞來昔布4.0 mg·kg-1·d-1，Sham組及OVX組分別給予同體積0.9％氯化鈉注射液，每

7、日1次。給藥劑量每周按體重校正1次。
　　 2.雙能X線吸收法確立PMOP動物模型
　　 于去勢后12周，分別取各組大鼠置于Osteocore3型雙能X線骨密儀上，通過計算機(jī)系統(tǒng)中心動物軟件，測量每只大鼠雙側(cè)股骨骨密度（BMD），取平均值。BMD值用g/c㎡表示。
　　 3.蘇木素-伊紅（HE）染色及免疫組織化學(xué)染色
　　 動物處死后，立即無菌操作取左側(cè)股骨下段，進(jìn)行HE染色、免疫組織化學(xué)染色及觀察。

8、r>　　 4.結(jié)果判定與圖像分析統(tǒng)計學(xué)分析
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用SPSS13.0軟件統(tǒng)計分析。所測數(shù)值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，方差齊性檢驗(yàn)采用Levene法，各組間變量比較采用完全隨機(jī)的單因素方差分析，并采用SNK法進(jìn)行兩兩比較；相關(guān)性分析用pearson積差相關(guān)分析。P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.試驗(yàn)前后各組大鼠體重變化比較
　　 實(shí)驗(yàn)前各組大鼠體重?zé)o明顯差別。試

9、驗(yàn)后與Sham組相比，OVX組及OVX+C組大鼠體重增加（P<0.05，P<0.05），OVX+E組大鼠體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與OVX組相比，OVX+E組及OVX+C組大鼠體重下降（P<0.05，P<0.05）；與OVX+E組相比，OVX+C組大鼠體重?zé)o明顯差別（P>0.05）。
　　 2.各組大鼠股骨BMD比較
　　 與Sham組相比，OVX組及OVX+C組大鼠BMD下降（P<0.05；P<0.05），

10、OVX+E組大鼠BMD差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與OVX組相比，OVX+E組及OVX+C組大鼠BMD亦增加（P<0.05；P<0.05）；與OVX+E組相比，OVX+C組大鼠BMD無明顯差別（P>0.05）。
　　 3.骨組織學(xué)觀察
　　 與Sham組大鼠比較，OVX組大鼠骨皮質(zhì)變薄，骨小梁稀疏或斷裂，骨髓腔增寬，OVX+E組大鼠與Sham組相似，OVX+C組大鼠介于Sham與OVX組之間。
　　 4.免

11、疫組織化學(xué)染色觀察
　　 NF-κB p65及COX-2蛋白陽性信號在四組大鼠骨組織中均有表達(dá)，NF-κB p65的陽性信號主要位于骨小梁周邊成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞中，骨髓基質(zhì)細(xì)胞亦呈陽性染色，COX-2的陽性信號主要位于骨小梁周邊成骨細(xì)胞中。
　　 5.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果
　　 與Sham組相比，OVX組及OVX+C組大鼠骨組織中NF-κB p65和COX-2陽性細(xì)胞染色灰度值增高（P<0.05，P<0.05）及（

12、P<0.05，P<0.05），OVX+E組有增高去勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，P>0.05）；與OVX組相比，OVX+E組及OVX+C組大鼠大鼠骨組織中NF-κB p65和COX-2陽性細(xì)胞染色灰度值下降（P<0.05；P<0.05）；與OVX+E組相比，OVX+C組大鼠大鼠骨組織中NF-κβp65和COX-2陽性細(xì)胞染色灰度值增高（P<0.05；P<0.05）。
　　 6.相關(guān)性分析
　　 OVX組及OVX+

13、C組大鼠骨組織中，NF-κB p65表達(dá)與BMD呈負(fù)相關(guān)（r=-0.765，P<0.05）及（r=-0.807，P<0.05），COX-2表達(dá)與BMD呈負(fù)相關(guān)（r=-0.793，P<0.05）及（r=-0.712，P<0.05），NF-κB p65和COX-2蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.803，P<0.05）和（r=0.784，P<0.05），而Sham組及OVX+E組大鼠骨組織中，NF-κB p65和COX-2蛋白表達(dá)水平之間及與B