柑橘潰瘍病相關WRKY轉錄因子和PR基因的篩選與功能分析.pdf

1、柑橘潰瘍病是由地毯草黃單胞桿菌柑橘致病變種（Xanthomonas axonopodis pv. citri，Xac）引起的一種細菌性病害，可影響大部分的商業(yè)柑橘栽培品種，造成嚴重的經濟損失。選育優(yōu)質抗病品種是解決該病害問題的根本途徑，其中，利用基因工程將抗病基因導入栽培品種是解決柑橘病害的一條快速而有效的途徑。
　　WRKY轉錄因子和病程相關蛋白（pathogenesis-related proteins，PRs）在植物抗病信號

2、調控途徑中起著重要作用。本研究根據柑橘潰瘍病高感品種紐荷爾臍橙（Citrus sinensis(L.) Osbeck）和高抗品種四季橘（Citrus madurensis）受潰瘍病侵染后的轉錄組數據，篩選了在這兩個品種中表達差異顯著的24個WRKY和4個PR基因進行研究，在此基礎上，詳細研究了4個WRKY基因和2個PR1基因在柑橘潰瘍病抗性中的功能和作用。具體研究結果如下：
　　1.候選基因的克隆和生物信息學分析
　　克隆了

3、CsWRKY22、CsWRKY50、CsWRKY72-1、CsWRKY72-2、和CsPR1-1、CsPR1-2的編碼序列，ORF分別為921bp、480bp、1809bp、1767bp、501bp和480bp。用 MEGA5.2軟件分析其與其他植物同家族蛋白氨基酸序列的親緣關系，并構建進化樹。發(fā)現 CsWRKY22與可可 WRKY29，CsWRKY50與棗 WRKY50，CsWRKY72與可可WRKY72，CsPR1-1與可可PR-1

4、，CsPR1-2與龍眼PR-1的親緣關系最近。
　　2. CsWRKY蛋白的亞細胞定位分析
　　構建亞細胞定位載體35S：GFP和35S：CsWRKY-GFP轉化洋蔥表皮細胞，熒光顯微鏡觀察顯示，對照組在整個細胞中均有表達，融合載體則特異性在細胞核中優(yōu)勢表達，表明CsWRKY蛋白為核定位蛋白。
　　3.柑橘潰瘍病誘導4個CsWRKY基因的表達
　　接種柑橘潰瘍病后，實時熒光定量PCR分析4個CsWRKY基因在感病

5、品種紐荷爾臍橙和抗病品種四季橘中的表達水平。結果顯示，接種潰瘍病后，CsWRKY22在紐荷爾臍橙中表達量高于四季橘，表明其可能參與柑橘的感病反應。CsWRKY50在四季橘中的表達水平明顯高于其在紐荷爾臍橙中的表達水平，表明CsWRKY50可能參與正調控柑橘的種間抗性，可能是一個抗性基因。CsWRKY72-1在紐荷爾臍橙和四季橘中的表達水平呈現下降趨勢，CsWRKY72-2在紐荷爾臍橙中的表達下調，在四季橘中表達水平沒有明顯變化。因此，柑

6、橘潰瘍病可能會抑制CsWRKY72-1和CsWRKY72-2介導的寄主基礎免疫。
　　4.水楊酸與茉莉酸甲酯誘導4個CsWRKY基因的表達
　　經水楊酸誘導后，4個CsWRKY基因在四季橘中的表達量下降，在紐荷爾臍橙中其表達水平有輕微上升趨勢，但變化不顯著。結果表明，水楊酸處理后，在四季橘中4個 CsWRKY基因的表達會受到抑制；而在紐荷爾臍橙中會誘導CsWRKY基因的表達。經茉莉酸甲酯處理后，4個CsWRKY基因在兩個品種

7、中的表達水平與經水楊酸處理后的結果相似，茉莉酸甲酯會誘導紐荷爾臍橙中4個CsWRKY基因的表達，但會抑制其在四季橘中的表達。
　　5.超量表達候選基因轉基因植株的獲得
　　為了評價候選基因在參與柑橘潰瘍病抗感性的作用，以pLGNe植物表達載體為骨架，構建了相關植物表達載體，并利用根癌農桿菌介導法將6個基因的超量表達載體分別轉化錦橙實生苗上胚軸。GUS組織化學染色法和 PCR技術篩選轉基因植株，獲得：CsWRKY22轉基因植株

8、9株，CsWRKY50轉基因植株5株，CsWRKY72-1轉基因植株10株，CsWRKY72-2轉基因植株5株，CsPR1-1轉基因植株2株，CsPR1-2轉基因植株8株。
　　6.轉基因植株潰瘍病抗病性評價
　　用柑橘潰瘍病病菌接種轉基因植株離體葉片，統(tǒng)計病斑面積，分析相關數據，進行轉基因植株抗性評價。結果顯示，CsWRKY22轉基因植株中出現3株感病性顯著增強的植株；CsWRKY72-1轉基因植株中中得到2株抗性顯著增強

9、的轉基因植株；CsPR1-1轉基因植株中有2株抗病性顯著性增強；CsPR1-2轉基因植株中有1株抗病性顯著增強的植株。其余轉基因植株與對照相比，抗性沒有顯著變化。
　　7.轉基因植株表型觀察
　　對轉基因植株表型進行分析，結果顯示，超量表達CsWRKY22的轉基因植株表現出了與其他轉基因植株差異很大的表型。具體表現為植株矮小、葉片窄小變厚、葉片向背面彎曲，其中3株轉基因植株表型變化最為顯著。結果表明，CsWRKY22轉基因植