柑橘潰瘍病相關(guān)WRKY轉(zhuǎn)錄因子和PR基因的篩選與功能分析.pdf

1、柑橘潰瘍病是由地毯草黃單胞桿菌柑橘致病變種（Xanthomonas axonopodis pv. citri，Xac）引起的一種細(xì)菌性病害，可影響大部分的商業(yè)柑橘栽培品種，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。選育優(yōu)質(zhì)抗病品種是解決該病害問題的根本途徑，其中，利用基因工程將抗病基因?qū)朐耘嗥贩N是解決柑橘病害的一條快速而有效的途徑。
　　WRKY轉(zhuǎn)錄因子和病程相關(guān)蛋白（pathogenesis-related proteins，PRs）在植物抗病信號

2、調(diào)控途徑中起著重要作用。本研究根據(jù)柑橘潰瘍病高感品種紐荷爾臍橙（Citrus sinensis(L.) Osbeck）和高抗品種四季橘（Citrus madurensis）受潰瘍病侵染后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選了在這兩個品種中表達(dá)差異顯著的24個WRKY和4個PR基因進(jìn)行研究，在此基礎(chǔ)上，詳細(xì)研究了4個WRKY基因和2個PR1基因在柑橘潰瘍病抗性中的功能和作用。具體研究結(jié)果如下：
　　1.候選基因的克隆和生物信息學(xué)分析
　　克隆了

3、CsWRKY22、CsWRKY50、CsWRKY72-1、CsWRKY72-2、和CsPR1-1、CsPR1-2的編碼序列，ORF分別為921bp、480bp、1809bp、1767bp、501bp和480bp。用 MEGA5.2軟件分析其與其他植物同家族蛋白氨基酸序列的親緣關(guān)系，并構(gòu)建進(jìn)化樹。發(fā)現(xiàn) CsWRKY22與可可 WRKY29，CsWRKY50與棗 WRKY50，CsWRKY72與可可WRKY72，CsPR1-1與可可PR-1

4、，CsPR1-2與龍眼PR-1的親緣關(guān)系最近。
　　2. CsWRKY蛋白的亞細(xì)胞定位分析
　　構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體35S：GFP和35S：CsWRKY-GFP轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察顯示，對照組在整個細(xì)胞中均有表達(dá)，融合載體則特異性在細(xì)胞核中優(yōu)勢表達(dá)，表明CsWRKY蛋白為核定位蛋白。
　　3.柑橘潰瘍病誘導(dǎo)4個CsWRKY基因的表達(dá)
　　接種柑橘潰瘍病后，實(shí)時熒光定量PCR分析4個CsWRKY基因在感病

5、品種紐荷爾臍橙和抗病品種四季橘中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，接種潰瘍病后，CsWRKY22在紐荷爾臍橙中表達(dá)量高于四季橘，表明其可能參與柑橘的感病反應(yīng)。CsWRKY50在四季橘中的表達(dá)水平明顯高于其在紐荷爾臍橙中的表達(dá)水平，表明CsWRKY50可能參與正調(diào)控柑橘的種間抗性，可能是一個抗性基因。CsWRKY72-1在紐荷爾臍橙和四季橘中的表達(dá)水平呈現(xiàn)下降趨勢，CsWRKY72-2在紐荷爾臍橙中的表達(dá)下調(diào)，在四季橘中表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。因此，柑

6、橘潰瘍病可能會抑制CsWRKY72-1和CsWRKY72-2介導(dǎo)的寄主基礎(chǔ)免疫。
　　4.水楊酸與茉莉酸甲酯誘導(dǎo)4個CsWRKY基因的表達(dá)
　　經(jīng)水楊酸誘導(dǎo)后，4個CsWRKY基因在四季橘中的表達(dá)量下降，在紐荷爾臍橙中其表達(dá)水平有輕微上升趨勢，但變化不顯著。結(jié)果表明，水楊酸處理后，在四季橘中4個 CsWRKY基因的表達(dá)會受到抑制；而在紐荷爾臍橙中會誘導(dǎo)CsWRKY基因的表達(dá)。經(jīng)茉莉酸甲酯處理后，4個CsWRKY基因在兩個品種

7、中的表達(dá)水平與經(jīng)水楊酸處理后的結(jié)果相似，茉莉酸甲酯會誘導(dǎo)紐荷爾臍橙中4個CsWRKY基因的表達(dá)，但會抑制其在四季橘中的表達(dá)。
　　5.超量表達(dá)候選基因轉(zhuǎn)基因植株的獲得
　　為了評價(jià)候選基因在參與柑橘潰瘍病抗感性的作用，以pLGNe植物表達(dá)載體為骨架，構(gòu)建了相關(guān)植物表達(dá)載體，并利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將6個基因的超量表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化錦橙實(shí)生苗上胚軸。GUS組織化學(xué)染色法和 PCR技術(shù)篩選轉(zhuǎn)基因植株，獲得：CsWRKY22轉(zhuǎn)基因植株

8、9株，CsWRKY50轉(zhuǎn)基因植株5株，CsWRKY72-1轉(zhuǎn)基因植株10株，CsWRKY72-2轉(zhuǎn)基因植株5株，CsPR1-1轉(zhuǎn)基因植株2株，CsPR1-2轉(zhuǎn)基因植株8株。
　　6.轉(zhuǎn)基因植株潰瘍病抗病性評價(jià)
　　用柑橘潰瘍病病菌接種轉(zhuǎn)基因植株離體葉片，統(tǒng)計(jì)病斑面積，分析相關(guān)數(shù)據(jù)，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株抗性評價(jià)。結(jié)果顯示，CsWRKY22轉(zhuǎn)基因植株中出現(xiàn)3株感病性顯著增強(qiáng)的植株；CsWRKY72-1轉(zhuǎn)基因植株中中得到2株抗性顯著增強(qiáng)

9、的轉(zhuǎn)基因植株；CsPR1-1轉(zhuǎn)基因植株中有2株抗病性顯著性增強(qiáng)；CsPR1-2轉(zhuǎn)基因植株中有1株抗病性顯著增強(qiáng)的植株。其余轉(zhuǎn)基因植株與對照相比，抗性沒有顯著變化。
　　7.轉(zhuǎn)基因植株表型觀察
　　對轉(zhuǎn)基因植株表型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，超量表達(dá)CsWRKY22的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出了與其他轉(zhuǎn)基因植株差異很大的表型。具體表現(xiàn)為植株矮小、葉片窄小變厚、葉片向背面彎曲，其中3株轉(zhuǎn)基因植株表型變化最為顯著。結(jié)果表明，CsWRKY22轉(zhuǎn)基因植