花生NAC轉錄因子的克隆和功能分析.pdf

1、花生是重要的油料作物和經(jīng)濟作物。我國是世界上種植花生的主要國家之一。花生產(chǎn)區(qū)主要分布于干旱和半干旱地區(qū)，干旱嚴重影響花生的產(chǎn)量和品質(zhì)，是花生生產(chǎn)的首要限制因子。我國有70％的花生面積受到不同程度的干旱危害，平均減產(chǎn)20％以上，造成巨大的經(jīng)濟損失。因此，解決干旱對花生生產(chǎn)的影響是當務之急。 植物在其生長過程中經(jīng)常會遭受到不同程度的生物和非生物逆境脅迫，這些脅迫嚴重影響植物的生長發(fā)育，并對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大的負面影響。研究發(fā)現(xiàn)，在長期

2、的生物進化過程中，植物自身已經(jīng)發(fā)展了多種抵抗干旱脅迫的機制，以通過調(diào)節(jié)自身生理和代謝變化來抵御干旱。其中的一個重要機制就是通過逆境脅迫信號轉導來啟動逆境脅迫響應基因的表達。在脅迫信號轉導途徑中，轉錄因子由于能夠調(diào)節(jié)多個脅迫響應功能基因的表達而備受關注。 NAC轉錄因子是近十年來發(fā)現(xiàn)的植物特有的轉錄調(diào)控因子，在植物生長發(fā)育、激素調(diào)節(jié)和防御抵抗多種生物和非生物脅迫、及作物產(chǎn)量和品質(zhì)等方面發(fā)揮重要作用。NAC轉錄因子的N端高度保守，

3、含有NAM保守結構域，為DNA結合區(qū)，C端則高度變異，為轉錄激活區(qū)。 我們從出口型大花生魯花14不同發(fā)育時期種子混合cDNA文庫中克隆鑒定出了2個花生NAC類基因，分別命名為AhNAC1( GenBank登錄號為EU669863)和AhNAC2。利用RT—PCR技術，從花生cDNA中擴增得到這兩個基因的cDNA全長。序列分析表明，AhNAC1基因的cDNA序列長度為1453 bp，其開放閱讀框(ORF)長度為912 bp，編碼3

4、03個氨基酸，預測其分子量為34.1 kD，等電點為7.6。而AhNAC2基因的cDNA為1573 bp，ORF為1050 bp，編碼349個氨基酸，預測其分子量為39.1 kD，等電點為7.66。通過與其他NAC蛋白序列比對，AhNAC1和AhNAC2均聚類到ATAF亞家族中，預測AhNAC1可能在花生種子發(fā)育中起作用，而AhNAC2可能參與了干旱等非生物脅迫反應。 在本實驗中，我們利用半定量RT—PCR的方法分析了AhNAC

5、2在干旱、鹽漬、低溫和ABA處理下的表達變化。結果表明：該基因的表達受到干旱誘導最為明顯，且其表達隨處理的時間出現(xiàn)峰值變化，而ABA處理后表達變化無明顯差異。 酵母轉錄激活實驗、區(qū)域缺失試驗和顯色反應證明了AhNAC2的激活域位于C端，而基因槍轉化洋蔥表皮細胞的瞬時表達表明了AhNAC2—GFP融合蛋白特異定位在細胞核中。這些結果表明AhNAC2具有轉錄因子的特征。 此外，為了功能驗證，我們構建了AhNAC2基因的過量表

6、達載體，并通過農(nóng)桿菌介導的葉盤轉化法成功轉到煙草中，篩選到轉基因株系，并對后代進行干旱耐受性分析，結果表明轉基因煙草抗旱能力較野生型顯著提高。而不同濃度ABA處理后，轉基因煙草與野生型無明顯差異。在正常生長狀態(tài)下，過量表達的轉基因株系可以誘導含有DRE/CRT元件的某些下游基因大量表達，而對照中表達量較低，因此推測AhNAC2基因可能具有誘導非生物脅迫相關的COR/RD基因表達的能力。此外，離體葉片的失水實驗也證明了轉基因株系的耐早能力