玉米WRKY轉(zhuǎn)錄因子IID亞族抗逆相關(guān)基因的鑒定及ZmWRKY17的功能分析.pdf

1、玉米是世界范圍內(nèi)重要的糧食作物之一，是公認(rèn)的黃金食物。但是其生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量品質(zhì)受到干旱、鹽漬等非生物脅迫的嚴(yán)重影響，挖掘抗逆相關(guān)基因，研究其逆境應(yīng)答機(jī)制，培育抗逆性較強(qiáng)的玉米新品種是應(yīng)對(duì)逆境脅迫，提高玉米產(chǎn)量的最有效途徑。近些年的研究表明，轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫應(yīng)答方面起著非常重要的作用。過量表達(dá)一個(gè)特定的轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控下游多個(gè)抗逆相關(guān)基因的表達(dá)，從而達(dá)到對(duì)作物進(jìn)行綜合改良的效果。WRKY蛋白家族是目前研究比較熱門的逆境相關(guān)轉(zhuǎn)

2、錄因子家族之一，其家族成員尤其是 IId亞族成員廣泛參與了植物對(duì)各種脅迫的應(yīng)答反應(yīng)、生長(zhǎng)發(fā)育、代謝調(diào)控等一系列生理活動(dòng)。本研究首先對(duì)玉米中IId亞族 WRKY基因的誘導(dǎo)表達(dá)模式、轉(zhuǎn)錄活性、以及鈣調(diào)素結(jié)合特性等分子特征進(jìn)行了系統(tǒng)分析。從玉米中克隆了脅迫相關(guān)關(guān)鍵基因 ZmWRKY17，通過過量表達(dá)技術(shù)對(duì)ZmWRKY17在轉(zhuǎn)基因植物中的抗逆功能進(jìn)行了驗(yàn)證，并利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探索，獲得了如下主要結(jié)果：
　　1.對(duì)玉

3、米中12個(gè) IId亞族 WRKY基因的分子特性進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)，玉米中7個(gè)IId亞族WRKY基因的表達(dá)均受到干旱和高鹽脅迫的誘導(dǎo)?？寺〉玫狡渲?個(gè)基因。酵母轉(zhuǎn)錄活性分析表明這6個(gè)IId亞族WRKY基因在酵母中均不具有轉(zhuǎn)錄激活能力。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)表明，6個(gè) IId亞族 WRKY蛋白均能夠與鈣調(diào)素發(fā)生相互作用。
　　2.根據(jù)進(jìn)化關(guān)系和誘導(dǎo)表達(dá)模式分析結(jié)果，選取了 ZmWRKY17作為關(guān)鍵基因進(jìn)行下一步的功能分析。序列分析顯示， Z

4、mWRKY17基因cDNA全長(zhǎng)為996bp，編碼331個(gè)氨基酸，與玉米B73數(shù)據(jù)庫中公布的序列完全一致。通過熒光定量PCR進(jìn)一步對(duì) ZmWRKY17的表達(dá)特性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)還受到外源 ABA的誘導(dǎo)。組織表達(dá)模式分析顯示，ZmWRKY17在根、莖、葉、花絲、雄穗、果穗和胚7個(gè)組織中均有表達(dá)，其中以雄穗中的表達(dá)水平最高。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示， ZmWRKY17-GFP的融合表達(dá)蛋白定位在細(xì)胞核中。酵母單雜交實(shí)驗(yàn)表明， ZmWRKY

5、17能夠與W-box序列發(fā)生特異性的結(jié)合。
　　3.構(gòu)建了 ZmWRKY17過量表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法獲得了多個(gè)擬南芥轉(zhuǎn)基因株系。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株進(jìn)行了抗鹽表型鑒定實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：在高鹽脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因植株的相對(duì)電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量均明顯高于野生型植株，說明過量表達(dá)ZmWRKY17提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)高鹽脅迫的敏感性。
　　4. ABA敏感性實(shí)驗(yàn)顯示ZmWRKY17的過量表達(dá)降低了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)外源ABA

6、的敏感性。另外，在外施ABA合成抑制劑的情況下，轉(zhuǎn)基因株系的種子在高鹽脅迫下的萌發(fā)受強(qiáng)烈抑制的表型得到恢復(fù)。
　　5.對(duì) ZmWRKY17作用機(jī)制進(jìn)行了初步探索，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)Ω啕}脅迫處理前后的擬南芥植株（包括野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株）進(jìn)行了基因差異表達(dá)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型擬南芥在高鹽處理后共獲得316個(gè)差異表達(dá)基因，轉(zhuǎn)基因株系中共獲得334個(gè)差異表達(dá)基因。通過對(duì)RD29B、RAB18、KIN1、DREB1F、bHLH92等多個(gè)

7、脅迫應(yīng)答功能基因的表達(dá)變化分析發(fā)現(xiàn)，在高鹽條件下，這些抗逆功能基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)上調(diào)變化程度顯著低于野生型植株。而 ABA合成相關(guān)基因NCED5在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)上調(diào)變化程度顯著高于野生型植株。
　　綜上所述，本研究首先對(duì)玉米中 IId亞族 WRKY基因的分子特性進(jìn)行了分析。根據(jù)誘導(dǎo)表達(dá)模式、進(jìn)化關(guān)系和序列特征等分析結(jié)果，選取了ZmWRKY17作為關(guān)鍵基因進(jìn)行下一步的功能研究。過量表達(dá)該基因顯著提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)高鹽脅