廣州管圓線蟲(chóng)病早期優(yōu)勢(shì)診斷抗原的篩選與初步鑒定.pdf

1、廣州管圓線蟲(chóng)[Angiostrongylus cantonesis]是動(dòng)物寄生蟲(chóng)，終宿主為哺乳動(dòng)物，主要是鼠類，中間宿主是陸生螺類或淡水螺類，如瑪瑙螺、福壽螺、蛞蝓等。大鼠是適宜終宿主，人和小鼠是非適宜宿主。成蟲(chóng)寄生于鼠類肺部血管，幼蟲(chóng)可侵入人體和小鼠體內(nèi)侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起神經(jīng)系統(tǒng)病變，導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞增多性腦膜炎或腦膜腦炎。臨床癥狀復(fù)雜多樣，給診斷帶來(lái)一定的困難。 Nomura等于1945年在臺(tái)灣報(bào)道了第一例廣州管圓線蟲(chóng)

2、病。迄今為止，全世界已有報(bào)道廣州管圓線蟲(chóng)病3000多例。隨著人們生活方式和飲食習(xí)慣的改變，廣州管圓線蟲(chóng)病的流行已由太平洋沿岸地區(qū)擴(kuò)展到美國(guó)、歐洲、澳大利亞等地區(qū)，在我國(guó)福建、臺(tái)灣等多個(gè)地區(qū)不斷出現(xiàn)多次散發(fā)或暴發(fā)病例。特別是最近兩次大的暴發(fā)流行均因食用生的或不熟的螺肉引起，其中包括2006年6月—9月北京暴發(fā)廣州管圓線蟲(chóng)病，臨床確診達(dá)160例之多；2008年4月云南大理州發(fā)現(xiàn)33例廣州管圓線蟲(chóng)病。廣州管圓線蟲(chóng)病日益成為威脅人民群眾健康的重

3、大傳染病之一，引起了衛(wèi)生工作者的重視。2003年衛(wèi)生部將廣州管圓線蟲(chóng)病列為我國(guó)新發(fā)傳染病。廣州管圓線蟲(chóng)病已成為嚴(yán)重威脅人類健康的人獸共患病之一，積極開(kāi)展該病的早期診斷和防治研究工作有著重要的現(xiàn)實(shí)意義，而快速有效的診斷方法是預(yù)防和治療該病的首要條件。 廣州管圓線蟲(chóng)病現(xiàn)有的各種實(shí)驗(yàn)室檢查中酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）是效果最好且方便推廣使用的檢測(cè)方法，而衡量ELISA檢測(cè)可靠性的關(guān)鍵是敏感性高、特異性強(qiáng)的診斷抗原、抗體。目前的臨床

4、檢測(cè)中，診斷抗原往往以粗抗原為主，常因缺乏特異性的診斷靶標(biāo)而與其他病原體存在交叉反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果不理想。IgM是病原體感染早期產(chǎn)生的抗體，從廣州管圓線蟲(chóng)體蛋白中篩選出產(chǎn)生IgM的特異性抗原成分，對(duì)廣州管圓線蟲(chóng)病的早期診斷具有重要意義。 1.研究目的 1.1.探索廣州管圓線蟲(chóng)病早期診斷時(shí)機(jī)。 1.2.篩選廣州管圓線蟲(chóng)病早期優(yōu)勢(shì)診斷抗原。 2.研究方法 2.1.從感染廣州管圓線蟲(chóng)的福壽螺中分離三期幼蟲(chóng)，

5、感染六周齡Balb/c小白鼠，分別于感染前及感染后的第1、2、3、4、8、16、21、28、38天斷尾取血。 2.2.經(jīng)方陣滴定確定最佳抗原包被量和血清最佳工作濃度，進(jìn)一步測(cè)定小鼠感染廣州管圓線蟲(chóng)后不同時(shí)期血清中IgM含量，留取IgM抗體含量?jī)?yōu)勢(shì)血清。 2.3.用廣州管圓線蟲(chóng)Ⅳ期幼蟲(chóng)粗抗原分別與感染廣州管圓線蟲(chóng)前后的小鼠血清進(jìn)行免疫印跡，篩選早期優(yōu)勢(shì)診斷抗原。 2.4.從SDS—PAGE膠中回收純化具有早期優(yōu)勢(shì)診

6、斷價(jià)值的蛋白成分。 2.5.Western—blotting驗(yàn)證回收蛋白活性和免疫反應(yīng)性。 2.6.方陣滴定確定抗原最佳包被濃度和血清最佳工作濃度，與Ⅳ期幼蟲(chóng)粗抗ELISA法同時(shí)檢測(cè)感染小鼠血清、廣州管圓線蟲(chóng)病人血清及其他寄生蟲(chóng)病人血清。 2.7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析比較二者檢測(cè)的敏感性和特異性，評(píng)價(jià)回收蛋白檢測(cè)價(jià)值。 3.研究結(jié)果 3.1.小鼠感染廣州管圓線蟲(chóng)后，其血清中特異性IgM抗體水平，在感染后

7、第一天即有上升趨勢(shì)，第1、2天上升緩慢，第3天開(kāi)始快速升高。 3.2.感染后第4天血清IgM抗體檢測(cè)陽(yáng)性率為48.33%（29/60），第8天血清IgM抗體檢測(cè)陽(yáng)性率已達(dá)95%（57/60）；感染后第16—20天IgM抗體水平基本持平，為第一個(gè)高峰，此時(shí)血清中IgM抗體檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果仍在90%以上，其中第16天為94.44%（51/54），第20天為90.70%（39/43）；感染后第28天下降到一個(gè)低值幾乎與感染后第4天IgM抗

8、體水平持平，此時(shí)陽(yáng)性檢測(cè)率為46%（6/13）。 3.3.用感染廣州管圓線蟲(chóng)后第8天血清，從廣州管圓線蟲(chóng)Ⅳ期幼蟲(chóng)粗抗原中成功篩選出具有早期優(yōu)勢(shì)診斷價(jià)值的32KD蛋白。 3.4.成功回收32KD蛋白，經(jīng)Western—blotting驗(yàn)證回收成分具有很強(qiáng)的蛋白活性和免疫反應(yīng)性。 3.5.經(jīng)ELISA檢測(cè)并與Ⅳ期幼蟲(chóng)粗抗原的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，回收蛋白的診斷特異性明顯高于Ⅳ期幼蟲(chóng)粗抗原；敏感性雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，卻較