夾心ELISA法檢測(cè)廣州管圓線蟲病循環(huán)抗原及初步應(yīng)用.pdf

1、廣州管圓線蟲(AngiostrongyluscantonensisAC)的幼蟲可侵入人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞增多性腦膜炎或腦膜腦炎，稱為廣州管圓線蟲病，簡(jiǎn)稱“酸腦”。而該病的確診依據(jù)，主要是從患者腦脊液、眼或尸解時(shí)從腦、脊髓腔或肺動(dòng)脈查到廣州管圓線蟲幼蟲、幼齡成蟲，但實(shí)際上蟲體檢出率很低，效果不太理想。
　　 自20世紀(jì)50年代以來，免疫學(xué)和免疫檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展為廣州管圓線蟲病提供了科學(xué)的診斷手段，同時(shí)隨著免疫學(xué)方法的改

2、進(jìn)和創(chuàng)新，大大提高了廣州管圓線蟲病診斷的準(zhǔn)確性。檢測(cè)廣州管圓線蟲病患者血清抗體存在以下缺陷：一是感染后抗體出現(xiàn)較晚；二是完全治愈后抗體仍會(huì)存在較長時(shí)間，無法進(jìn)行現(xiàn)癥感染診斷和療效考核；三是與其他蠕蟲存在交叉反應(yīng)。檢測(cè)循環(huán)抗原(CAg)則可以克服以上的問題，因此我們對(duì)夾心ELISA法檢測(cè)廣州管圓線蟲病患者血清中循環(huán)抗原進(jìn)行研究非常有意義。
　　 目的：
　　 制備抗廣州管圓線蟲五期幼蟲55KD抗原的單克隆抗體和相應(yīng)的多克隆

3、抗體，采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)廣州管圓線蟲病人血清中的循環(huán)抗原，并確定最佳檢測(cè)條件，探討其在廣州管圓線蟲病檢測(cè)方面的意義。
　　 方法：
　　 (1)電滲純化廣州管圓線蟲五期幼蟲55KD抗原，并用此抗原免疫小鼠后，進(jìn)行細(xì)胞融合，有限稀釋法篩選出高滴度分泌McAb的雜交瘤細(xì)胞株，獲取分泌抗廣州管圓線蟲五期幼蟲55KD抗原的雜交瘤細(xì)胞株。蛋白質(zhì)免疫印跡(Westernblotting)及間接ELISA分析其特異性，初步

4、探討其在廣州管圓線蟲病診斷及治療中的應(yīng)用。
　　 (2)用廣州管圓線蟲五期幼蟲55KD抗原免疫兔子，制備多克隆抗體。用多克隆抗體和單克隆抗體建立雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)廣州管圓線蟲病人血清中循環(huán)抗原，并確定最佳檢測(cè)條件，利用該法進(jìn)行人群血清檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)篩選出2株高滴度分泌抗廣州管圓線蟲五期幼蟲55KD抗原的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為AVC1和ACV2。Westernblotting顯示2株單

5、克隆抗體均能與廣州管圓線蟲五期幼蟲55KD抗原發(fā)生特異性結(jié)合，經(jīng)免疫球蛋白類和亞類鑒定均為IgG2b，免疫組化結(jié)果顯示2株單克隆抗體與廣州管圓線蟲五期幼蟲的識(shí)別部位主要是在廣州管圓線蟲體表和消化道。
　　 (2)雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)條件的確定
　　 包被抗原濃度選定為1.0mg/ml，檢測(cè)抗體的最佳工作濃度應(yīng)在0.2mg/1，酶標(biāo)抗體的最佳工作濃度應(yīng)在1∶1000，包被方式和封閉方式分別為4℃包被過夜、37℃封閉2

6、小時(shí)，反應(yīng)時(shí)間為標(biāo)本孵育時(shí)間60分鐘、檢測(cè)抗體孵育時(shí)間60分鐘、酶結(jié)合物孵育時(shí)間45分鐘的反應(yīng)體系。
　　 (3)建立雙抗體夾心ELISA法，檢測(cè)諸暨、溫州、樂清、瑞安和蒼南等地的人群血清，對(duì)應(yīng)陽性率分別為0.6％、0.59％、0.57％、0.98％、2.43％、1.86％、1.18％。
　　 結(jié)論:
　　 (1)制備的2株穩(wěn)定分泌抗廣州管圓線蟲五期幼蟲55KD抗原單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，特異性和穩(wěn)定性較好，有