廣州管圓線蟲(chóng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建分析及廣州管圓線蟲(chóng)病療效考核抗原的篩選鑒定.pdf

1、廣州管圓線蟲(chóng)病(Angiostrongyliasis)是由廣州管圓線蟲(chóng)(Angiostrongyluscantonensis)感染而引起的。作為一種新發(fā)的食源性傳染性疾病，廣州管圓線蟲(chóng)病在全球的流行都呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，對(duì)人類的威脅也越來(lái)越大。廣州管圓線蟲(chóng)主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起嗜中性粒細(xì)胞增多性腦膜炎或腦膜腦炎。感染該病后，絕大多數(shù)患者有頭痛、肌肉痛、惡心、嘔吐、感覺(jué)異常、觸摸痛、發(fā)熱、畏光、視力模糊、嗜睡、頸硬等癥狀。其中以頭痛最突

2、出，患者自訴“頭痛欲裂”或忍受不了；全身疼痛、皮膚過(guò)敏的現(xiàn)象也比較嚴(yán)重；個(gè)別病人還會(huì)出現(xiàn)精神病樣癥狀。我國(guó)是廣州管圓線蟲(chóng)病的主要流行區(qū)之一，近幾年的發(fā)病數(shù)逐漸增多，甚至出現(xiàn)了爆發(fā)流行。如何有效地防治廣州管圓線蟲(chóng)病已成為亟待解決的重要問(wèn)題。 在廣州管圓線蟲(chóng)病的防治工作中，診斷是關(guān)鍵。診斷明確，治療及時(shí)，則病人的轉(zhuǎn)歸一般良好。但目前國(guó)內(nèi)外都還缺乏敏感特異、能產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)、標(biāo)準(zhǔn)化的診斷試劑盒。針對(duì)目前這個(gè)難點(diǎn)問(wèn)題，本論文進(jìn)行了以下研究：

3、 一、廣州管圓線蟲(chóng)幼蟲(chóng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)基因表達(dá)模式分析 鑒于廣州管圓線蟲(chóng)在人體的感染和致病階段主要為幼蟲(chóng)，本文構(gòu)建了廣州管圓線蟲(chóng)腦期幼蟲(chóng)的cDNA文庫(kù)，并用EST(expressedsequencetag)方法對(duì)其基因表達(dá)譜和成蟲(chóng)的基因表達(dá)譜進(jìn)行了初步分析，目的是對(duì)此新發(fā)傳染病病原的分子生物學(xué)特征進(jìn)行了解和為診斷性抗原的篩選提供庫(kù)源。 從感染廣州管圓線蟲(chóng)3周的大鼠腦部挑取幼蟲(chóng)，提取其總RNA，運(yùn)用“

4、SMARTcDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒”構(gòu)建其cDNA文庫(kù)。所建文庫(kù)的初始滴度為2.19×106pfu/ml，經(jīng)1次擴(kuò)增后的滴度為1.0×1010pfu/ml，插入子的平均長(zhǎng)度為1.2kb，重組率為97.3％。 分別將成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)和我室構(gòu)建的幼蟲(chóng)cDNA文庫(kù)中的噬菌體克隆轉(zhuǎn)化成噬菌粒，用5'端測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序。利用BLAST程序?qū)Λ@取的EST從核苷酸和氨基酸水平進(jìn)行同源性搜索，對(duì)成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。從成蟲(chóng)的cDNA文庫(kù)

5、中得到64個(gè)EST，其中與其它基因有同源性的EST有54個(gè)，占82.8％；沒(méi)有同源性的EST有10個(gè)，占17.2％。64個(gè)成蟲(chóng)EST序列中，rRNA基因49個(gè)，占總EST數(shù)的76.6％。從幼蟲(chóng)的cDNA文庫(kù)中共得到106個(gè)EST，其中與其它基因有同源性的EST有91個(gè)，占85.8％；無(wú)同源性的EST有15個(gè)，占14.2％。106個(gè)幼蟲(chóng)EST序列中rRNA基因78個(gè)，占總EST數(shù)的73.6％。本研究首次成功構(gòu)建了廣州管圓線蟲(chóng)幼蟲(chóng)的cDNA

6、文庫(kù)，EST分析顯示廣州管圓線蟲(chóng)幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)基因表達(dá)譜中rRNA基因均占大多數(shù)。 二、廣州管圓線蟲(chóng)新基因的發(fā)現(xiàn)及初步研究 應(yīng)用EST策略，我們從廣州管圓線蟲(chóng)腦期幼蟲(chóng)cDNA文庫(kù)中篩到了兩個(gè)包含全長(zhǎng)讀碼框的cDNA序列G40基因及G172基因，并已在GenBank中登錄(登錄號(hào)分別是DQ384534及DQ384535)。G40及G172基因分別與秀麗桿線蟲(chóng)半凝乳素-8及膠原蛋白140高度同源。從保守結(jié)構(gòu)域的搜索結(jié)果可知，G4

7、0具有半凝乳素結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能專一性地與β-半乳糖苷結(jié)合，如乳糖，而不需要金屬離子的活化。半凝乳素以二聚體或三聚體結(jié)構(gòu)域存在，它們進(jìn)程性地受到調(diào)節(jié)，還可能參與了細(xì)胞分化、細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用及細(xì)胞調(diào)節(jié)。G172基因編碼的蛋白經(jīng)保守結(jié)構(gòu)域的搜索，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有已報(bào)道的結(jié)構(gòu)域。G40及G172基因分別用pET32a(+)質(zhì)粒在BL21大腸桿菌中表達(dá)，G40基因的表達(dá)產(chǎn)物與感染大鼠血清有明顯的免疫反應(yīng)性，是種具有潛力的診斷用抗原，而G172基因

8、在pET32a(+)/BL21系統(tǒng)中不表達(dá)，可能與該蛋白對(duì)細(xì)胞具有毒性有關(guān)。 三、廣州管圓線蟲(chóng)病療效考核大鼠模型的建立 本研究從褐云瑪瑙螺中分離Ⅲ期幼蟲(chóng)，以50條/只腹腔接種感染SD大鼠。于治療前從各組分別抽取感染鼠解剖觀察廣州線蟲(chóng)的感染情況，確定各組大鼠均感染成功后，用50、100和200mg/kg/d3個(gè)不同劑量的阿苯達(dá)唑分別對(duì)感染大鼠進(jìn)行連續(xù)3天的治療。 為保證感染大鼠能得到有效的治療，采用了3個(gè)不同劑量的

9、阿苯達(dá)唑分別對(duì)感染大鼠進(jìn)行治療，但21w后仍有少數(shù)大鼠體內(nèi)檢獲到蟲(chóng)體。這有可能是所用動(dòng)物的樣本量不同或所用藥物的批號(hào)不同所致。63只感染大鼠中，總共41只大鼠未檢獲到蟲(chóng)體，治療的總有效率達(dá)65.1％(41/63)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每2周采集大鼠血清，建立了這41只大鼠的感染前、感染后以及治療后不同時(shí)期的血清。該大鼠血清足夠用于廣州管圓線蟲(chóng)病療效考核抗原的篩選。 四、廣州管圓線蟲(chóng)病療效考核分子的篩選與鑒定 針對(duì)廣州管圓線蟲(chóng)療效考

10、核問(wèn)題，建立了進(jìn)行療效考核的大鼠動(dòng)物模型，分析了治療前后廣州管圓線蟲(chóng)感染大鼠血清中IgG抗體的消長(zhǎng)，篩選潛在的療效考核抗原分子。方法是用治療前后廣州管圓線蟲(chóng)感染的大鼠血清與廣州管圓線蟲(chóng)進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)。結(jié)果顯示分子量于38kDa～78kDa之間的抗原分子與未經(jīng)治療和驅(qū)蟲(chóng)治療后的感染大鼠血清的反應(yīng)帶無(wú)明顯差別，分子量為19kDa和17kDa的抗原與未經(jīng)治療感染大鼠血清出現(xiàn)較強(qiáng)的反應(yīng)，而與治療后血清未出現(xiàn)反應(yīng)帶，32kDa和24kDa抗原與

11、未經(jīng)治療感染大鼠血清出現(xiàn)較強(qiáng)的反應(yīng)，而與治療后大鼠血清的反應(yīng)帶明顯變?nèi)?；治療后血清與蟲(chóng)體抗原在16kDa處出現(xiàn)反應(yīng)帶，而治療前血清在該處未見(jiàn)反應(yīng)帶；AC-IgG抗體在感染大鼠治療后17周的陰轉(zhuǎn)率達(dá)80％(8/10)。因而我們得出結(jié)論，廣州管圓線蟲(chóng)19kDa，17kDa，32kDa，24kDa，16kDa抗原具有潛在的療效考核價(jià)值。 綜上所述，本文構(gòu)建了廣州管圓線蟲(chóng)腦期幼蟲(chóng)的cDNA文庫(kù)，并用EST方法對(duì)其基因表達(dá)譜和成蟲(chóng)的基因表

12、達(dá)譜進(jìn)行了初步分析，對(duì)廣州管圓線蟲(chóng)的分子生物學(xué)特征進(jìn)行了解和為診斷性抗原的篩選提供庫(kù)源。成功建立了廣州管圓線蟲(chóng)療效考核大鼠模型，獲得了一批廣州管圓線蟲(chóng)感染前、治療前以及治療后不同時(shí)期的大鼠血清。利用這些療效考核血清從廣州管圓線蟲(chóng)成蟲(chóng)可溶性抗原中篩選到一批具有潛在療效價(jià)值的抗原分子，并對(duì)其中的Mr32000抗原(AC32)進(jìn)行了純化，利用純化的AC32建立了廣州管圓線蟲(chóng)療效考核檢測(cè)體系，解決了目前廣州管圓線蟲(chóng)診斷試劑緊缺問(wèn)題，為廣州管圓線