Survivin基因和促血管形成因子表達(dá)及對(duì)腦膠質(zhì)瘤血管生成調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、血管形成在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移過程中均發(fā)揮著重要作用。目前的研究結(jié)果表明，如果沒有血管生成，原發(fā)性腫瘤的生長(zhǎng)不會(huì)超過1～2mm3。
　　腫瘤血管生成過程中涉及到血管生成因子與血管生成抑制因子之間的調(diào)節(jié)失衡。目前已分離和純化了20多種血管生成因子，主要包括血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、酸性及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF，bFGF)、血小板衍化生長(zhǎng)因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血管生成

2、素(angiogenin)、胎盤生長(zhǎng)因子(PIGF)、白介素-8和腫瘤壞死因子α(TNFα)等。
　　腫瘤治療的抗血管生成是近幾年的研究熱點(diǎn)，抗血管生成治療具有其他方法無可比擬的優(yōu)點(diǎn)：(1)抗血管生成治療作用具有放大效應(yīng)，因?yàn)橐粋€(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞支持50～100個(gè)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)；(2)血管內(nèi)皮細(xì)胞暴露在血液中，藥物能夠直接發(fā)揮作用，所用藥物劑量小、療效高；（3）抗血管生成治療對(duì)正常內(nèi)皮細(xì)胞影響不大，具有良好的特異性；（4）血管內(nèi)皮細(xì)胞基

3、因表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，不易產(chǎn)生耐藥性。
　　本課題在前期研究中于國(guó)內(nèi)外首次證明：凋亡蛋白抑制因子（IAP）家族的Survivin和腦膠質(zhì)瘤血管生成密切相關(guān)。然而，和腫瘤血管生成最密切的促血管生成因子在Survivin和腫瘤血管生成之間的作用機(jī)制如何？截至目前，還沒有這方面的研究報(bào)道。有關(guān)Survivin與腦膠質(zhì)瘤血管形成的關(guān)系以及和促血管形成因子（VEGF、bFGF和PDGF）基因的表達(dá)調(diào)節(jié)作用的關(guān)系，國(guó)內(nèi)外也沒有研究報(bào)道。因此，Sur

4、vivin在腦膠質(zhì)瘤血管形成中的作用機(jī)制尚不清楚，有必要對(duì)Survivin與腦膠質(zhì)瘤血管形成的關(guān)系以及促血管形成因子（VEGF、bFGF和PDGF）基因的表達(dá)調(diào)節(jié)在其中的作用機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。
　　基于上述分析，本實(shí)驗(yàn)首先研究了促血管形成因子（VEGF、bFGF和PDGF）對(duì)Survivin的mRNA和蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)作用，分析了促血管形成因子與人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和SHG-44的Survivin基因表達(dá)的上調(diào)關(guān)系機(jī)制；進(jìn)而，

5、構(gòu)建Survivin基因真核表達(dá)載體，建立穩(wěn)轉(zhuǎn)的SHG-44/SVV細(xì)胞系，在體外實(shí)驗(yàn)分別研究Survivin和促血管形成因子在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)變化的關(guān)系，進(jìn)一步在體內(nèi)試驗(yàn)觀察Survivin對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞血管形成的生物學(xué)特性的影響。通過以上研究，初步探討了Survivin在人腦膠質(zhì)瘤血管形成中的作用和機(jī)理。
　　本課題擬從以下三個(gè)方面進(jìn)行了具體的實(shí)驗(yàn)研究：
　　1促血管形成因子對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞Survivin表達(dá)影響的

6、體外實(shí)驗(yàn)
　　在體外培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞（無Survivin表達(dá)）和U251細(xì)胞（高表達(dá)Survivin）中，分別加入適量的VEGF、bFGF和PDGF，于不同時(shí)間點(diǎn)（0h、3h、6h、12h、24h），分別采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR、Westernblot和免疫組化方法，檢測(cè)Survivin基因mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化，并進(jìn)行圖像處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照、陰性對(duì)照和內(nèi)對(duì)照（β-actin），觀察上述促血管

7、形成因子在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中是否能夠上調(diào)Survivin基因的表達(dá)。在體外培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞中，分別和促血管形成因子（VEGF、bFGF和PDGF）作用的不同時(shí)間點(diǎn)，均無Survivin基因和蛋白表達(dá)，和陽性對(duì)照組比較表達(dá)量均有顯著差異（P均<0.01）。在體外培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中，分別和促血管形成因子（VEGF、bFGF和PDGF）作用的不同時(shí)間點(diǎn)，均有大量Survivin基因和蛋白表達(dá)，和陽性對(duì)照組比較表達(dá)量均

8、無顯著差異（P>0.05）。以上研究結(jié)果表明，促血管形成因子（VEGF、bFGF和PDGF）能明顯上調(diào)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中Survivin基因和蛋白表達(dá)。對(duì)于無Survivin表達(dá)的人腦膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞，促血管形成因子（VEGF、bFGF和PDGF）無上調(diào)Survivin表達(dá)的作用。
　　2SHG-44/SVV細(xì)胞系的建立及Survivin基因?qū)Υ傺苄纬梢蜃樱╒EGF、bFGF和PDGF）表達(dá)影響的體外實(shí)驗(yàn)
　　

9、設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增Survivin基因整個(gè)編碼區(qū)序列的特異性引物，采用RT-PCR方法從高表達(dá)Survivin基因的人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中克隆Survivin基因cDNA編碼區(qū)序列，構(gòu)建Survivin基因真核表達(dá)載體，對(duì)克隆產(chǎn)物進(jìn)行基因序列分析，以驗(yàn)證目的片段的正確性，同時(shí)行酶切鑒定。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染無Survivin基因表達(dá)的人腦膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Survivin基因的SHG-44/SVV細(xì)胞系，同時(shí)設(shè)立轉(zhuǎn)染

10、空載體的SHG-44/Emy細(xì)胞。采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR、Westernblot和免疫組化方法，分別檢測(cè)SHG-44/SVV細(xì)胞系、SHG-44/Emy和SHG-44原型細(xì)胞中Survivin基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平，并進(jìn)行圖像處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以證明SHG-44/SVV細(xì)胞系獲得特異的外源性Survivin基因的表達(dá)。并分別檢測(cè)上述促血管形成因子（VEGF、bFGF和PDGF）mRNA和蛋白在體外培養(yǎng)的SHG-44/SVV細(xì)胞系

11、、SHG-44/Emy和SHG-44原型細(xì)胞中的表達(dá)水平，每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)分別設(shè)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和內(nèi)對(duì)照（β-actin），對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行圖像處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以證明在體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Survivin基因?qū)@3種促血管形成因子是否具有上調(diào)其表達(dá)作用。在SHG-44/SVV細(xì)胞系中，均有大量Survivin基因和蛋白表達(dá)，和陽性對(duì)照組比較Survivin表達(dá)量均有顯著差異（P均<0.01），驗(yàn)證了SHG-44/SVV細(xì)胞系獲得了外源Sur

12、vivin基因，成功地建立了穩(wěn)轉(zhuǎn)的SHG-44/SVV細(xì)胞系。在體外培養(yǎng)的SHG-44/SVV細(xì)胞系中，進(jìn)一步分別檢測(cè)促血管形成因子（VEGF、bFGF和PDGF）的mRNA和蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)VEGF、bFGF和PDGF的mRNA和蛋白均有大量表達(dá)，和陽性對(duì)照組比較VEGF、bFGF和PDGF的mRNA和蛋白表達(dá)量有顯著差異（VEGF、bFGF組P<0.01，PDGF組P<0.05）。以上結(jié)果提示：在體外培養(yǎng)的SHG-44/SVV細(xì)胞

13、系中，Survivin表達(dá)上調(diào)和促血管形成因子（VEGF、bFGF和PDGF）表達(dá)上調(diào)呈正相關(guān)關(guān)系。
　　3Survivin基因在裸鼠人腦膠質(zhì)瘤組織中對(duì)促血管形成因子（VEGF、bFGF和PDGF）表達(dá)及對(duì)人腦膠質(zhì)瘤血管形成和腫瘤生長(zhǎng)增殖影響的活體實(shí)驗(yàn)
　　將SHG-44/SVV、SHG-44/Emy和SHG-44原型細(xì)胞分別接種于裸鼠背部皮下，每組細(xì)胞接種6只裸鼠，建立人腦膠質(zhì)瘤裸鼠皮下移植瘤模型。定期觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，測(cè)

14、量腫瘤體積，觀察期滿后處死動(dòng)物，取出瘤組織，稱瘤重。通過采用免疫組化方法檢測(cè)八因子相關(guān)抗原（FⅧRAg）的表達(dá)，以計(jì)算各組腫瘤標(biāo)本的微血管密度（MVD）。采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR、免疫組化方法，分別檢測(cè)各組腫瘤標(biāo)本VEGF、bFGF和PDGFmRNA和蛋白的表達(dá)水平，每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)分別設(shè)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和內(nèi)對(duì)照（β-actin），對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行圖像處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過本實(shí)驗(yàn)以證明在膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤中Survivin基因?qū)@3種促血管形成因

15、子是否具有上調(diào)其表達(dá)作用。結(jié)果顯示，與SHG-44/Emp和SHG-44原型細(xì)胞組裸鼠相比，SHG-44/SVV組裸鼠腫瘤形成時(shí)間明顯提前，腫瘤生長(zhǎng)快，瘤體積及瘤重均明顯增加（P均<0.01）。采用免疫組化SABC方法檢測(cè)Survivin、FⅧRAg在各組腫瘤標(biāo)本中的表達(dá)，分別計(jì)算各組腫瘤組織的MVD。結(jié)果表明，與SHG-44/Emy和SHG-44原型細(xì)胞組相比，SHG-44/SVV組腫瘤組織Survivin蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。上述研究結(jié)

16、果提示，Survivin基因可明顯上調(diào)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞裸鼠移植瘤的VEGF、bFGF和PDGF的mRNA和蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)了血管形成，其機(jī)制與Survivin基因明顯上調(diào)促血管形成因子的表達(dá)水平有關(guān)。
　　綜上所述，Survivin可能是人腦膠質(zhì)瘤血管形成過程中的一個(gè)關(guān)鍵基因，其機(jī)制為促血管形成因子對(duì)Survivin基因表達(dá)有上調(diào)作用，Survivin基因表達(dá)正反饋?zhàn)饔糜诖傺苄纬梢蜃?，上調(diào)促血管形成因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)了血管形