下調(diào)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞CXCR4表達(dá)對膠質(zhì)瘤侵襲和血管生成能力的影響.pdf

1、隨著干細(xì)胞研究領(lǐng)域的飛速發(fā)展和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，“腫瘤干細(xì)胞”理論再次引起人們的關(guān)注，并為越來越多的學(xué)者所接受。該理論認(rèn)為：腫瘤是一個異質(zhì)性的群體，只有腫瘤干細(xì)胞亞群具備自我更新、多向分化以及成瘤能力，而非腫瘤干細(xì)胞(包括祖細(xì)胞、分化的腫瘤細(xì)胞)則缺乏這些能力。研究者先后在白血病、乳腺癌、腦腫瘤、結(jié)腸癌、肝癌、前列腺癌等至少20類腫瘤中證實(shí)了腫瘤干細(xì)胞的存在，并對其多種重要的生物學(xué)特性進(jìn)行了細(xì)致的觀察，包括治療抵抗性、促血管生成能力、侵襲

2、特性、免疫源性等。隨著研究的深入，越來越多的研究者相信，這群數(shù)量稀少、性質(zhì)特殊的細(xì)胞，才是惡性腫瘤發(fā)生、進(jìn)展以及治療后復(fù)發(fā)的根源，而探索針對腫瘤干細(xì)胞亞群的靶向治療措施，是今后惡性腫瘤治療的重要方向之一。 趨化因子受體CXCR4屬于7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體家族，可被其特異性配體SDF-1激活。CXCR4在多種腫瘤中都具有很強(qiáng)的促侵襲和促血管生成能力。在膠質(zhì)瘤中，CXCR4的表達(dá)與腫瘤的級別呈正相關(guān)，其活化后可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲，

3、并且活化后還可以通過上調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞VEGF的分泌量來促進(jìn)腫瘤的血管生成。近期的研究表明，從原代膠質(zhì)瘤標(biāo)本中獲取的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞高表達(dá)CXCR4。然而CXCR4在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的作用尚需進(jìn)一步研究。 在本研究中，首先，采用間接免疫熒光標(biāo)記驗(yàn)證U87細(xì)胞及其顱內(nèi)移植瘤標(biāo)本中膠質(zhì)瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD133是否和CXCR4共表達(dá)。然后，我們采用si-RNA(小干擾RNA)下調(diào)U87細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)，并且分別從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CXCR4小干擾R

4、NA質(zhì)粒的U87細(xì)胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒的U87細(xì)胞中培養(yǎng)出膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球，并對其進(jìn)行鑒定，同時觀察兩者CXCR4的表達(dá)情況。在此基礎(chǔ)上我們進(jìn)一步通過Transwell小室比較兩者的侵襲能力；采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測兩者細(xì)胞培養(yǎng)上清內(nèi)VEGF的含量。我們還采用上述膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的裸鼠顱內(nèi)移植瘤，在體內(nèi)觀察其VEGF的分泌的情況和腫瘤的微血管密度的差別。主要的結(jié)果和結(jié)論如下： 1.U87細(xì)胞中膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的CXCR4

5、表達(dá)情況 用免疫熒光標(biāo)記U87細(xì)胞及其瘤顱內(nèi)移植瘤標(biāo)本，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察CXCR4和CD133的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，U87細(xì)胞及其建立的顱內(nèi)移植瘤中均可以檢測到CD133和CXCR4雙陽性的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞 2.獲取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CXCR4干擾質(zhì)粒的U87細(xì)胞 獲取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞后，我們對干擾效果進(jìn)行檢測了檢測。Western blot結(jié)果顯示，干擾組1細(xì)胞的CXCR4表達(dá)水平下降較明顯；干擾組2略有下降；而干擾組

6、3則幾乎沒有效果。我們選用干擾組1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，并用RT-PCR對其干擾效果從RNA水平進(jìn)行了進(jìn)一步的檢驗(yàn)，結(jié)果表明干擾組CXCR4水平顯著下降。 3.膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球的篩選和鑒定 (1)用逐漸添加神經(jīng)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的方法，成功地分別從干擾組與對照組U87細(xì)胞中培養(yǎng)出膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球。在于細(xì)胞培養(yǎng)基中，分化的腫瘤細(xì)胞貼壁并且生長受到抑制，而GSCs能夠在培養(yǎng)基中呈克隆球樣懸浮生長。 (2)兩組膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球均表達(dá)膠

7、質(zhì)瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物CD133和nestin，并且從干擾組U87細(xì)胞中獲得的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球，其CXCR4的表達(dá)較對照組明顯降低。 4.下調(diào)CXCR4表達(dá)對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞趨化和侵襲能力的影響 (1)下調(diào)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞CXCR4表達(dá)后，體外趨化結(jié)果顯示，干擾組的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至微孔膜下表面的細(xì)胞數(shù)明顯少于對照組。在每個高倍鏡視野下，干擾組僅有60±7.3個細(xì)胞穿過微孔轉(zhuǎn)移至膜的下方，對照組卻有166±11.2個細(xì)胞轉(zhuǎn)移至膜的下方

8、(P<0.05)。 (2)體外侵襲試驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾組的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至微孔膜下表面的細(xì)胞數(shù)也少于對照組。干擾組為：17±5.8個/HPF，對照組為：71±8.7個/HPF(P<0.05)。 5.下調(diào)CXCR4表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分泌VEGF (1)分別在24 h、48 h時用ELISA檢測各組膠質(zhì)瘤干細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF的含量。結(jié)果顯示，下調(diào)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞CXCR4表達(dá)后，其VEGF的分泌量也隨之降低。在24

9、 h時干擾組和對照組VEGF的分泌量分別為690+24 pg/ml和850±25 pg/ml(P<0.05)，在48 h時干擾組和對照組VEGF的分泌量分別為1504±53 pg/ml和2001±150 pg/ml(P<0.05)。 (2)我們在進(jìn)一步在體內(nèi)對其進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示：干擾組膠質(zhì)瘤干細(xì)胞建立的顱內(nèi)移植瘤的微血管密度和VEGF的分泌量均小于對照組。 綜上所述，U87細(xì)胞中的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞上表達(dá)CXCR4，從干擾的

10、U87細(xì)胞中可以培養(yǎng)出膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，它們也表達(dá)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物，而且從干擾組中培養(yǎng)出的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的CXCR4表達(dá)水平要低于對照組；此外，干擾組的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的趨化和侵襲能力下降，同時其分泌VEGF的能力也低于對照組，并且干擾組膠質(zhì)瘤干細(xì)胞建立的裸鼠顱內(nèi)移植瘤模型中微血管密度和VEGF的分泌量也低于對照組。結(jié)果提示下調(diào)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的CXCR4表達(dá)可以抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的趨化和侵襲，并且可以下調(diào)其促血管生成能力。提示：CXCR4可能是膠