雄性小鼠睪丸支持細(xì)胞中Attractin的功能研究.pdf

1、華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文雄性小鼠睪丸支持細(xì)胞中Attractin的功能研究姓名：李潔申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：婦產(chǎn)科學(xué)指導(dǎo)教師：熊承良20090501華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文 華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文 II第二部分 干擾 Atrn 表達的小鼠睪丸支持細(xì)胞株的建立 目的：第二部分 干擾 Atrn 表達的小鼠睪丸支持細(xì)胞株的建立 目的：通過基因轉(zhuǎn)染和 RNA 干擾技術(shù)，使小鼠睪丸支持細(xì)胞中內(nèi)源

2、性 Atrn 表達受到抑制，進一步研究 Atrn 在睪丸支持細(xì)胞中的作用。 方法： 方法：本實驗采用Q-PCR、Western blot 以及免疫熒光方法檢測小鼠睪丸支持細(xì)胞株TM4細(xì)胞中Atrn mRNA和蛋白的表達。 針對Atrn的編碼序列中3段siRNA靶序列設(shè)計相應(yīng)DNA序列,將其插入H1啟動子下游,克隆到真核表達載體psiRNA -hH1neo中,轉(zhuǎn)化DH5α菌株擴增,提取質(zhì)粒通過酶切鑒定和DNA測序鑒定。將重組載體在陽離子脂

3、質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)下瞬時轉(zhuǎn)染TM4細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染試劑組（liposome）、陰性對照組(psiRNA -hH1)、空白對照組 (未轉(zhuǎn)染的TM4細(xì)胞) 通過Q-PCR和Western blot法檢測轉(zhuǎn)染第3天Atrn mRNA、蛋白表達水平，確定有效序列，用含有該序列的重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞， G418篩選， 建立穩(wěn)定干擾Atrn表達的睪丸支持細(xì)胞株， 并用Q-PCR和ELISA分別對其分泌產(chǎn)物抑制素α (Inhα

4、) mRNA和細(xì)胞培養(yǎng)液中的抑制素B (Inb B)的表達進行了檢測， 以探討在細(xì)胞水平抑制內(nèi)源性Atrn的表達對支持細(xì)胞功能的影響。結(jié)果： 結(jié)果：小鼠睪丸支持細(xì)胞株TM4細(xì)胞表達Atrn mRNA和蛋白。構(gòu)建重組載體psiAtrn-770、psiAtrn-2273、psiAtrn-2908，酶切鑒定及DNA 測序結(jié)果顯示插入片斷正確。將重組載體瞬時轉(zhuǎn)染TM4細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后72h, 以psiAtrn-2273 和psiAtrn-2908轉(zhuǎn)

5、染組抑制Atrn mRNA和蛋白表達效果明顯（P 0.05）。質(zhì)粒psiAtrn -2273能有效地阻斷支持細(xì)胞內(nèi)源性基因的表達，以質(zhì)粒psiAtrn -2273穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TM4細(xì)胞獲得穩(wěn)定干擾Atrn表達的TM4細(xì)胞株psiAtrn-TM4，以空質(zhì)粒psiRNA-hH1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后得到的細(xì)胞株psiRNA-TM4為后續(xù)實驗對照， psiAtrn-TM4細(xì)胞中Atrn mRNA表達抑制率約為80.1%，蛋白表達抑制率約為72.98%。當(dāng)At