大鼠肝細胞與睪丸支持細胞混合共微囊化的體外功能研究.pdf

1、目的：本研究試將大鼠肝細胞(Hepatocytes)和同源的睪丸支持細胞(Sertolicells，SCs)混合培養(yǎng)后進行共微囊化(Co-microencapsulation)，觀察肝細胞與睪丸支持細胞混合共微囊化對肝細胞生物學(xué)活性的支持作用。 方法：利用微囊發(fā)生器制備含肝細胞、睪丸支持細胞及兩者混合細胞的微囊，首先，摸索兩種細胞的最佳混合比；然后根據(jù)微囊內(nèi)包裹細胞種類的不同，分為微囊化肝細胞組，微囊化睪丸支持細胞組，肝細胞、睪

2、丸支持細胞分別微囊后共同培養(yǎng)組和肝細胞、睪丸支持細胞混合共微囊組。觀察囊內(nèi)細胞形態(tài)，體外培養(yǎng)測定培養(yǎng)液中Alb與尿素的分泌，判斷各組囊內(nèi)肝細胞活性和功能。樣本比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的多元方差分析。 結(jié)果： (1)包裹混合細胞的微囊呈球形，表面光滑，直徑600～800μm，細胞懸浮于囊內(nèi)，每個微囊含150～200個細胞。 (2)體外培養(yǎng)96h時，光學(xué)顯微鏡下見微囊仍呈球形，表面光滑；細胞均勻散在分布于微囊內(nèi)，數(shù)量無明

3、顯變化；囊內(nèi)肝細胞、睪丸支持細胞呈圓形，而在體外培養(yǎng)的非微囊包裹的睪丸支持細胞則較快地貼壁并呈梭形生長。 (3)純化后的肝細胞濃度為90％，睪丸支持細胞濃度為85％。 (4)與純肝細胞微囊組相比，一定比例的睪丸支持細胞可促進共微囊化肝細胞的Alb分泌和尿素合成(P＜0.01)，肝細胞存活時間也相應(yīng)延長。 (5)肝細胞和睪丸支持細胞以20:1比例混合時即能達到最佳效果。 (6)微囊化睪丸支持細胞組培養(yǎng)液上清

4、中無法檢測出Alb與尿素。 (7)與微囊化肝細胞組相比，肝細胞、睪丸支持細胞分別微囊后共同培養(yǎng)組與肝細胞、睪丸支持細胞混合共微囊組肝細胞的存活時間延長，培養(yǎng)液上清中Alb分泌(F=217.56，P＜0.001)和尿素合成量(F=232.72，P＜0.001)明顯增加。 (8)混合細胞共微囊組于培養(yǎng)第7天Alb與尿素含量最高(分別為2.80±0.11mg/ml，1.92±0.10μmol/L)，而其它兩組均于培養(yǎng)第3天Al

5、b與尿素含量達到最高(2.48±0.08mg/ml，1.47±0.08μmol/L；2.27±0.10mg/ml，1.37±0.05μmol/L)。 (9)相對于肝細胞、睪丸支持細胞混合共微囊組，肝細胞、睪丸支持細胞分別微囊后共同培養(yǎng)組在培養(yǎng)后期Alb、尿素含量下降趨勢更明顯。 結(jié)論： 1.采用胰酶+EDTA法分離肝細胞，可獲得較高產(chǎn)量和活力的肝細胞，與膠原酶分離法相比，大大節(jié)省了實驗成本。 2.采用膠原

6、酶+胰酶法分離睪丸支持細胞，可獲得較高純度和數(shù)量的睪丸支持細胞。 3.肝細胞與睪丸支持細胞以20:1進行混合，可最大程度發(fā)揮肝細胞的功能。 4.微囊化睪丸支持細胞單獨培養(yǎng)組無法檢測出Alb與尿素，說明睪丸支持細胞本身并不分泌Alb與尿素，將其設(shè)為參照組，更能排除可能由睪丸支持細胞帶來的影響。 5.肝細胞、睪丸支持細胞混合共微囊組Alb分泌和尿素合成量明顯高于其他兩組，提示睪丸支持細胞對肝細胞有重要的支持、營養(yǎng)作用