雷公藤、夾竹桃及常見有毒生物堿的中毒、檢測及評價研究.pdf

1、植物廣泛分布在自然界，與人們的生活息息相關(guān)。但植物自身的化學(xué)成分復(fù)雜，其中有很多具有毒性，因治療不當(dāng)、誤食、他殺和意外所致的中毒案件時有發(fā)生。由于植物中所含有毒成分復(fù)雜多樣、毒性大、在中毒者體內(nèi)含量低、代謝迅速且中毒無特異性臨床表現(xiàn)等問題，使復(fù)雜生物體系中相關(guān)目標(biāo)物的檢測與評價成為法醫(yī)毒物分析的技術(shù)難題。雷公藤是我國重要的天然藥物資源，且是近半個世紀(jì)以來發(fā)生中毒事件最多的中草藥之一，其毒性在傳統(tǒng)中草藥中排名第三。隨著雷公藤的臨床應(yīng)用范圍

2、越來越廣，其毒副作用也越來越受到人們的關(guān)注。雷公藤甲素是從雷公藤中分離得到的二萜類內(nèi)酯，是雷公藤的主要有效成分之一，也是引起毒副作用的主要成分；雷公藤酯甲為雷公藤中的三萜類成分，也具有明顯的毒副作用。而夾竹桃是一種因其毒性而聞名的具有觀賞價值的中草藥。歐夾竹桃苷是存在于夾竹桃中的主要有毒成分，屬遲效強心苷類物質(zhì)，有較強的致吐作用。由于雷公藤和夾竹桃毒性較大，與此相關(guān)的中毒案件時有發(fā)生。此外在司法鑒定實踐中還經(jīng)常遇到攝入未知有毒生物堿導(dǎo)致

3、中毒甚至死亡的案件。雷公藤、夾竹桃及多種有毒生物堿的相關(guān)研究在法醫(yī)毒物鑒定中涉獵較少，僅見零星報道，且現(xiàn)有報道的檢測方法不能滿足體內(nèi)痕量、快速及多目標(biāo)物同時分析的需求，對于相關(guān)毒代動力學(xué)的研究、分析結(jié)果的評價和判斷也仍存在一定的局限性，不夠全面。因此建立可靠、準(zhǔn)確、快速及靈敏的生物檢材中相關(guān)目標(biāo)物的篩選與檢測體系，繼而研究相關(guān)的毒代動力學(xué)特征，對于該類案件的法醫(yī)學(xué)鑒定及評判極為重要。
　　本論文擬通過分別開發(fā)、建立簡便、靈敏、準(zhǔn)確

4、的復(fù)雜生物體系中雷公藤、夾竹桃及常見有毒生物堿的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）分析方法以及開展以大鼠為中毒動物模型的雷公藤甲素毒代動力學(xué)研究，將其研究成果應(yīng)用到司法鑒定實踐中，為臨床診治、法醫(yī)鑒定提供取材指導(dǎo)以及相應(yīng)的技術(shù)保障和評價依據(jù)。
　　本論文的研究內(nèi)容共分為四章。
　　第一章為雷公藤的中毒、檢測及毒代動力學(xué)研究。本章分為兩個研究部分，第一部分首創(chuàng)了多種生物檢材中痕量雷公藤甲素及雷公藤酯甲的液液提取高效液相色

5、譜串聯(lián)質(zhì)譜（LLE-LC-MS/MS）的同時檢測法，并進(jìn)行了全面、系統(tǒng)的方法學(xué)驗證。本方法以納洛酮為內(nèi)標(biāo)，檢測時間為10 min。血液、尿液及組織中雷公藤甲素、雷公藤酯甲及內(nèi)標(biāo)納洛酮三種物質(zhì)分離良好。目標(biāo)物在5-500 ng/mL（ng/g）內(nèi)均有良好的線性，相關(guān)系數(shù)﹥0.9950，最低檢出限均為2 ng/mL（ng/g），回收率均大于60％，基質(zhì)效應(yīng)為82.06%-107.43%，方法的準(zhǔn)確度為90.61%-105.80%，日內(nèi)精密度

6、與日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%。該方法解決了生物檢材中痕量雷公藤甲素及雷公藤酯甲的定性定量問題，適用于雷公藤中毒的法醫(yī)毒物分析和臨床藥物監(jiān)測。第二部分建立了雷公藤主要有效及毒性成分-雷公藤甲素的大鼠中毒實驗?zāi)Ｐ汀Ｍㄟ^動物實驗，考察灌胃給予大鼠毒性劑量的雷公藤甲素后，雷公藤甲素在大鼠體內(nèi)的藥時曲線、組織分布及排泄特征。結(jié)果表明在本研究的給藥劑量下，雷公藤甲素在大鼠血液中的濃度隨時間的變化趨勢符合一級動力學(xué)消除的二室模型，三個毒性劑

7、量內(nèi)仍呈現(xiàn)出線性動力學(xué)性質(zhì)，血藥濃度隨著給藥劑量的增加而增加；各組織濃度在不同時間點的變化規(guī)律均為：5min﹥15min﹥60min，其中肝、腎組織中濃度較高，可作為檢案取材參考；藥物在糞便中排出量較大，推測雷公藤甲素大部分以原藥形式排出體外。大鼠對雷公藤甲素的吸收存在一定的個體差異，但無顯著的性別差異。研究結(jié)果可對雷公藤中毒相關(guān)案例的鑒定及評價提供指導(dǎo)信息和參考依據(jù)。
　　第二章為夾竹桃的中毒、檢測及評價。建立了多種生物檢材中夾

8、竹桃主要毒性成分歐夾竹桃苷的LLE-LC-MS/MS分析方法，并進(jìn)行了全面、系統(tǒng)的方法學(xué)驗證。本方法使用外標(biāo)法，血液和肝組織中歐夾竹桃苷在5-500 ng/mL和20-2000 ng/g范圍內(nèi)均呈現(xiàn)出良好的線性，相關(guān)系數(shù)﹥0.9950，最低檢出限分別為1 ng/mL和2 ng/g?；厥章示笥?0%，基質(zhì)效應(yīng)為91.52%-106.39%，方法的準(zhǔn)確度在91.07%-111.63%，日內(nèi)精密度與日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于12%。本方

9、法成功應(yīng)用于夾竹桃中毒死亡案件的鑒定，且經(jīng)文獻(xiàn)檢索及線性離子阱-靜電場軌道阱質(zhì)譜（LTQ-Orbitrap-MS）技術(shù)對分子式的測定，在多種檢材中均檢測推斷出歐夾竹桃苷的代謝物歐夾竹桃苷元。本方法中歐夾竹桃苷和歐夾竹桃苷元得到了良好的分離。方法靈敏度高、選擇性好、簡便快速，適用于夾竹桃中毒案件的法醫(yī)毒物分析和臨床診斷。
　　第三章為LC-MS/MS法同時篩選血液中的45種有毒生物堿及其案例應(yīng)用。本章建立了同時篩選血液中45種常見有

10、毒生物堿的LLE-LC-MS/MS分析方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗證。本方法以SKF525A為內(nèi)標(biāo)，一次進(jìn)樣分析僅需12 min。目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)SKF525A分離均良好，且45種目標(biāo)生物堿在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)均有良好的線性，相關(guān)系數(shù)﹥0.9950，最低檢出限為0.05-25 ng/mL，方法的準(zhǔn)確度在85.90%-114.95%，日內(nèi)精密度與日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%。所建方法靈敏度高、選擇性好、簡便高效，可用于法醫(yī)毒物分析和臨床藥物監(jiān)

11、測中常見未知生物堿中毒的篩選與確證，為相關(guān)中毒案件提供科學(xué)的技術(shù)手段。
　　第四章總結(jié)了本論文的研究成果及創(chuàng)新點，并提出進(jìn)一步的研究方向，為深入探討雷公藤等常見有毒植物成分的中毒、篩選、鑒定與評價提供研究基礎(chǔ)。
　　1、本論文首次創(chuàng)建了多種生物檢材中痕量雷公藤甲素及雷公藤酯甲的LC-MS/MS同時檢測方法，該方法簡便、快速，適用于雷公藤中毒的法醫(yī)學(xué)鑒定和臨床診治。且全面、系統(tǒng)地研究了毒性劑量下的雷公藤甲素在大鼠體內(nèi)的毒代動力

12、學(xué)過程。
　　2、建立了復(fù)雜生物檢材中歐夾竹桃苷的LC-MS/MS法，并進(jìn)行了全面的方法學(xué)驗證。該方法簡便，快捷，靈敏度高，并成功應(yīng)用于一例夾竹桃中毒死亡案件的鑒定，首次分析了人體各組織中的歐夾竹桃苷濃度分布特點，且在多種檢材中均檢出歐夾竹桃苷的代謝物歐夾竹桃苷元，為夾竹桃中毒的鑒定實踐提供了更多指導(dǎo)信息。
　　3、建立了同時篩選血液中45種常見有毒生物堿的LC-MS/MS法，所建方法簡便、靈敏、快速、可靠，能滿足常見未知有